Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Однако мы приведем здесь в качестве ориентиров некоторые общие характеристики устойчивости нескольких гелей. Декстраны, такие, как сефадекс, устойчивы в растворах солей, органических растворителях, растворах щелочей и слабокислых растворителях, но гидролизуются в сильных кислотах. Декстраиы во влажном н в сухом состоянии устойчивы при выдерживапии их в течение 30 мии при 12! 'С и рН 7,0. Агарозы, например сефарозы, не содержат поперечных сшивок и, следовательно, могут храниться при рН от 4 до 9 и температуре от 2 до 30'С. Они устойчивы в ! М НаС! и 2 М мочевине. Поперечно-связанная агароза (сефароза С1.) устойчива при рН от 3 до 9, однако при ее использовании следует избегать условий, способствующих ес окислению.
Она высокоустойчива в 3 М тиоционате калия, сильном хаотропном агенте. Перенесение сефарозы СЕ из воды в некоторые органические растворители сопровождается лишь небольшим изменением размеров пор. Ее можно многокоатно стерилизовать при рН 7,0 и температуре 110 — 120'С. Полиакриламиды, такие, как биогель Р, достаточно устойчивы в разбавленных органических кислотах, 8 М мочевнне, 6 М гуанндннгндрохлориде, хаотропных агентах и детергентах. Для разделения белков рекомендуется использовать буферы с ионной силой 0,5 М.
В присутствии некоторых смешивающихся с водой растворителей, например спирта (до концентрации 20%), размеры пор фактически не изменшотся. Биогель Р устойчив при комнатной температуре (рН 2 — !О) и пря автоклавировании (121'С, рН 6 — 8). ЧАСТЬ 1Ч МЕТАБОЛИЗМ Конструкция и размеры колонок Во многих случаях применения гель-фильтрации, например при обессоливании растворов, не требуется высокого разрешения, и, следовательно, для этих целей можно использовать самодельные нли одноразовыс ординарные колонки. Однако в ответственных случаях для успешного разделения веществ с помощью гельфнльтрацин, как н во всех других видах хроматографии, нужна надлсжащпм образом сконструированная колонка и другое связанное с ней оборудование. Следует обратить внимание иа то, что над слоем геля н под ним не должно быть значительного «мертвого» объема, в котором происходит смешивание протекающих через него растворов.
При наличии такого объема искажается форма градиента и элюирующихся пиков, а также характер ступенчатого изменения состава элюента. В продаже имеются колонки, в которых фактически нет «мертвого» объема под слоем геля. В колонках другого типа «мертвое» пространство отсутствует как снизу, так и сверху хроматографического слоя благодаря тому, что эти колонки снабжены специальными приспособлениями для введения элюента и отбора элюата. Такие приспособления полезны также ппи проведении восходящей хроматографии, Не рекомендуется применять поддерживающие пластинки из пористого стекла, особенно в случае гелей с низкой степенью сщивки и высокой пористостью.
Разрешение зависит от длины колонки, емкость которой пропорциональна плошади ее поперечного сечения. Однако применение гелей с меньшими размерами частиц повьппает степень разрешения и позволяет использовать более короткие колонки. Поскольку ширина зоны нанесенного на гель образца определяется также его объемом, длину и ширину колонки выбирают в зависимости от той степени разрешения, которую необходимо достичь при данном объеме пробы: для более эффективного разделения требуется более длинная колонка, а для получения более узкой исходной зоны — более широкая. На колонке с высотой хроматографического слоя 51 см легко обессолить белок, получив его в небольшом объеме элюата, тогда как, например, для 228 м еизичкскив матоды частичного разделения набора пептидов, образовавшихся при расщеплении какого-либо фермента цпанбромидом, нужна более длинная колонка (300 см).
Наиболее приемлемы колонки с внутренним диаметром 2,5 см, хотя можно использовать и более узкие, При применении очень узких колонок возникают стеночные эффекты за счет большего вклада ламинарного потока, расширяющего хроматографические зоны. При чрезмерно большом диаметре неизбежны ненужное разбавление н трудности, связанные с поддержанием горизонтальной формы зон. Заполнение колонок Количество сухого геля, требуемое для заполнения данной колонки, можно рассчитать по объему набухшего геля, который приводится в брошюрах, выпускаемых фирмами-изготовителями. Для гелей, поставляемых в виде суспензии, необходимость в таких расчетах отпадает. В этом случае гелю дают набухнуть, выдерживая его в объеме элюента, вдвое превышающем ожидаемый объем набухшего геля. Время, необходимое для набухания геля, зависит от объема впитываемой жидкости.
Для набухании гелей с высокой степенью сшивки и низкой емкостью, таких, как сефадексы 6-10, 6-15, 6-25, 6-50 и Н!.-50, а также биогель Р, требуется 3— 4 ч прн комнатной температуре, тогда как сефадексы 6-75 — 6-200 набухают в течение 1 — 3 дней.
При температуре 90 — 100'С это время сокращается до 1 — 5 ч. Набухание в кипящей воде способствует удалению пузырьков воздуха, от которых приходится избавляться под вакуумом, если набухание проводится прн комнатной температуре. Гели, выпускаемые в набухшем виде, разбавляют до такой степени, чтобы легко можно было удалить все пузырьки воздуха. Следует избегать перемешивания. Набухшему гелю дают постоять некоторое время, а затем избыточный растворнтель сливают для получения густой суспензии, консистенция которой всетаки не мешает удалению пмзырьков воздуха.
Гели, поставляемые в виде суспензин, при необходимости разбавляют до такой же консистенции. ЧАСТЬ Пл МЕТАБОЛИЗМ Колонку устанавливают, закрепляя ее в вертикальном положении. Затем в нее подают элюент, лучше всего снизу, до тех пор пока мертвое пространство под слоем геля не будет заполнено и из него не выйдут все пузырьки воздуха, Закрыв выходное отверстие колонки, вливают в нее сразу всю суспензию геля, распределяя ее равномерно по стенке колонки или наливая на палочку.
Затем добавляют элюент до самого верха колонки, подсоединяют ее к резервуару с элюентом и выпускают все оставшиеся пузырьки воздуха через отверстие в верхней части колонки. Если невозможно ввести в колонку всю суспензню геля за один прием, к колонке присоединяют удлинитель и сразу же начинают вливать в нее суспензию. Не рекомендуется заполнять колонку жидкой суспензией, вводить суспензию в колонку, содержашую элюент, или добавлять ее в несколько приемов.
Нельзя допускать обсыхания хроматографического слоя. Чтобы избежать этого, выходную трубку изгибают в виде петли, расположенной выше поверхности геля. Ввод пробы Перед вводом пробы на поверхность геля помешают либо кружок фильтровальной бчмаги, либо перфорированный пластмассовый диск, либо специальное приспособление для введения проб, которое представляет собой пластмассовый цилиндр с дном из найлоновой сетки.
Затем проверяют гомогенность хроматографического слоя, а также определяют свободный объем (УБ) и объем жидкости (Уз+У,), пропуская через колонку смесь дскстрана синего (2 мг/мл) и феррицианида калия или какого-то другого окрашенного вещества с небольшими размерами молекул. Пробу осторожно наслаивают на поверхность геля после удаления избытка элюента. Выходное отверстие колонки должно быть открыто до тех пор, пока проба не войдет в слой геля. Стенки колонки над поверхностью геля промывают небольшим количеством элюента. Затем колонку осторожно заполняют элюентом и после удаления из нее, а также из соединительных трубок пузырьков воздуха колонку присоединяют к резер- и физнчкскнв методы куару, в котором поддерживается постоянный уровень элюента (сосуд Мариотта).
Такой сосуд представляет собой колбу с выходным отверстием у дна, соединенным через трубку с колонкой. Колба закрывается сверху пробкой с проходящей через нее стеклянной трубкой, которую можно установить на нужную высоту. Трубка расположена ниже поверхности элюента и поддерживает постоянное гидростатическое давление. Пробу можно также наносить на поверхность геля, не удаляя находящийся над ним слой элюента. В этом случае проба должна быть более плотной, чем элюент.
При необходимости добавляют сахарозу или какую-либо соль. Наслаивание пробы производят с помощью пипетки или капиллярной трубки, присоединенной к шприцу. Фирма Рпагп1ас!а, (пс. разработала н поставляет проточные соединительные устройства (адапторы) для своих колонок. Они представляют собой своего рода пробки, соединенные с нарезными трубками, проходящими через концы колонки и заканчивающиеся калиллярными шлангами. Два таких адаптора, тесно примыкающие к внутренним стенкам колонки, можно плотно пригнать с помощью нарезных стержней к нижней и верхней поверхностям геля. При этом пробу наносят непосредственно на слой геля, затем пропускают элюент, который вытекает через нижнюю поверхность геля.
Элюирование Скорость потока можно регулировать, изменяя гидростатическое давление, которое определяется высотой столба жидкости от ее уровня в резервуаре с элюентом и до выходного отверстия в колонке, до тех пор пока не будет превышепо максимальное давление, допустимое для данного вида геля. Резервуар с элюентом, или сосуд Мариотта, как и любое другое аналогичное устройство, а также выходной конец трубки устанавливают так„чтобы разница между уровнем жидкости в резервуаре илн в трубке сосуда Марнотта и ее уровнем в выходном отверстии колонки не превышала допустимой разницы в высоте столба жидкости (гидростатическом давлении).
Постоянную скорость истекания жидкости можно также поддерживать с помощью насоса, соблю- 231 члсть пл мйтлволизм дая те же предосторожности. При использовании гелей с высокой степенью сшивки максимальная скорость гравитационного потока намного превышает скорость потока, необходимую для достижения оптимального разделения или получения острых пиков. Если степень сшивки геля невелика, скорость потока может быть ограничена только допустимым гидростатическим давлением. В том случае, если жидкость протекает под действием силы тяжести, уровень элюента и скорость потока поддерживаются постоянными с помощью сосуда Мариотта. Факторы, влияющие на остроту пиков Для достижения наивысшего разрешения необходимо, чтобы свободный объем хроматографического слоя находился в равновесии с внутренним объемом гранул.
При гель-фильтрации смесей веществ с приблизительно одинаковыми размерами молекул это возможно только при очень низких скоростях потока. Таким образом, при установлении скорости потока необходимо учитывать время разделения и разрешающую способность. В аналитической работе основная роль принадлежит разрешению, тогда как в прспаративных опытах важнее быстрота разделения. При гель-фильтрации на сефарозах используется скорость от 2 до 8 мл/см9/мин, при обессоливанни на сефадексс б-15 хорошие результаты получают при скорости 12 мл/см'/мин, а при разделении на сефадексе б-200 скорость может составлять от 5 до 20 мл/см'/мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
