Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 47
Текст из файла (страница 47)
В ряде случаев никаких других удобных способов просто не существует. Кроме того, методам с применением изотопов присуща высокая чувствительность, что необходимо для проведения многих видов исследований. Как отмечается в другом разделе данного руководства (разд. 18.2.2), количество фермента пропорционально скорости превращения субстрата или образования продукта. Следовательно, необходимо иметь данные об изменении концентрации субстрата или продукта в зависимости от времени.
Для того чтобы анализ был достоверным, начальная скорость реакции должна быть постоянной в течение небольшого промежутка времени и пропорциональной содержанию фермента в исследуемой пробе Некоторые приборы, такие, как спектрофотометры и рН-метры, позволяют непрерывно следить за скоростью реакции в одной анализируемой пробе, причем ход реакции часто регистрируется самописцем па бу.
мажной ленте. Однако в других случаях, как, например, при исследовании ферментов с помощью радиоизотопов, скорость реакции можно определять лишь путем периодического измерения радиоактивности в отдельных аликвотах реакционной смеси. м Физичвские метОДы Одна из основных трудностей, возникающих при проведении таких анализов, связана с необходимостью отделения радиоактивного субсграта от радиоактивных продуктов. Обычно меченый субстрат присутствует в количествах, необходимых для насыщения фермента, и, следовательно, реакция по своим кинетическим параметрам является реакцией псевдонулевого порядка, т. е. ее скорость остается постоянной в течение длительного промежутка времени.
При использовании чувствительных и надежных методов анализа количество образующегося продукта может составлять лишь 1% количества присутствующего субстрата. Поэтому необходимо отделить небольшое количество радиоактивного продукта от очень большого количества радиоактивно~о субстрата. Успешное достижение этой цели зависит от того, будет ли найден эффективный метод разделения, который позволит получить препараты этих двух веществ, содержащие 0,1$, или менее примеси другого вещества.
Применяемые методы разделения часто специально предназначены для какого-либо конкретного случая, поэтому их описание не входит в нашу задачу. Мы дадим лишь краткий обзор общих методов разделения. В работе Олдхэма 1541 они рассматриваются более подробно. Существуют следующие методы разделения: 1) осаждение макромолекул, таких, как полинуклеотиды, полипептиды и полисахариды; 2) выделение или поглощение летучих меченых соединений, например 'Н~О, ЫСО~ или летучих жирных кислот, которые можно отделить от других веществ перегонкой или иным способом; 3) экстракция растворителем; 4) ионный обмен; 5) хроматография на бумаге или в тонком слое н электрофорез; 6) адсорбция и элюция; 7) выделение производных; 8) превращение иемеченого продукта в меченое производное; 9) диализ и гель-фильтрация; 10) обратное изотопное разбавление.
Степень загрязнения продукта субстратом в процессе их выделения ограничивает чувствительность применяемого метода. Допустим, например, что примесь субстрата в продукте после их разделения составляет 0,1$. Допустим также, что скорость счета в нулевое время (т.
е. когда продукт еще не образовался) равна 100 имп!Мин, что объясняется наличием перекрестного 243 чАсть гу метАБОлизм загрязнения. Желательно, чтобы скорость счета, обусловленная образовавшимся продуктом, по крайней мере равнялась скорости счета в нулевое время, т. е. составляла бы 100 ими/мни при 0,57а-ном превращении субстрата. В этом случае соотношение сигнала и фонового шума равно 1:1, что означает минимальную чувствительность прн не слишком высоких скоростях счета (разд. 16.4.4).
Чтобы получить указанную скорость счета, минимальная скорость счета для субстрата при анализе всего образца должна составлять 100000 имп/мнн. Ьолее высокая радиоактивность не приведет к повышению чувствительности, так как соответственно возрастет и скорость счета в нулевое время. Конечно, повышение радиоактивности продукта до уровня, превосходящего скорость счета в нулевое время, уменьшит ошибку определения. Однако образование слишком больших количеств продукта нарушает необходимые для получения достоверных результатов условия, обеспечивающие псевдонулевой порядок реакции.
Из приведенного примера видно, что, хотя для насыщения фермента нужно добавлять достаточное количество субстрата, его радиоактивность не обязательно должна быть высокой. С другой стороны, если удалось полностью разделить между собой субстрат и продукт, чувствительность метода становится пропорциональной удельной активности субстрата и ограничивается только стоимостью, целесообразностью применения и доступностью этого субстрата. В этих условиях исследователи могут предпочесть субстраты, меченные 'Н, а не "С, так как за ту же цену они могут купить препарат, удельная активность которого в 100 раз выше (см. ниже о трудностях, связанных с применением 'Н).
Разбавление радиоактивного субстрата нерадиоакзивным способствует насыщению фермента субстратом и создает ряд дополнительных преимуществ. В частности, оно дает возможность снизить 1) затраты на радиоактивный материал, так как позволяет использовать меньшее количество изотопа; 2) влияние примесей и продуктов радиационного распада в радиоактивных субстратах; 3) действие нежелательного стереоизомера в радиоактивном субстрате, состоящем из смеси изомеров, в результате добавления немеченого субстрата с нуж- 244 м чизичяскиг мстоды ной стереоконфигурацией; 4) радиационный распад субстрата.
Такое разбавление повышает также точность определений. Поскольку ферментатнвная активность выражаезся в международных единицах (МЕ) и 1 МЕ равна такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата за 1 мин в стандартных условиях, скорость счета следует выражать в мкмоль|мин, используя удельную активность субстрата (который будет превращен в продукт предположительно с такой же удельной активностью). При определении удельной активности субстрата путем измерения радиоактивности и концентрации часто допускаются ошибки.
Хотя удельная активность применяемого радиоизотопа обычно известна с точностью до ч-5%, этот препарат редко используется как таковой, чаще он разбавляется большими количествами нерадиоактивной формы, что приводит к соответствующим погрешностям в измерениях радиоактивности и в определении чистоты препарата. Поэтому рекомендуется точно определять удельную радиоактивность субстрата, используемого в экспериментах. Кроме того, может возникнуть необходимость проверки радио- химической чистоты субстрата или его предварительной очистки с целью удаления продуктов распада и других примесей. Особые трудности, встречающиеся ари работе с субстратами, меченными тритием Тритий проявляет изотопный эффект по отношению к водороду, так как обладает намного большей массой, чем водород.
Этот эффект наиболее сильно выражен тогда, когда образование или разрушение связи между тритием или водородом и каким-то другим атомом является этапом, лимитирующим скорость реакции. Изотопный эффект может возрасти до такой степени, что реакция с меченными тритием соединениями практически не будет идти, как это наблюдается при карбоксилировании (.-рибулозо-5-фосфата с участием зН-г)АРН-фосфата и СО,. Изотопный эффект может проявляться в виде изменений )т ., или Км фермента при использовании меченного тритием субстрата. Если ЧАСТЬ Ш МЕТАБОЛИЗМ Км снижается, эффект не будет наблюдаться при условии насыщения фермента субстратом.
При повышении Км скорость реакции будет снижаться, если концептра. ция субстрата оказывается недостаточной для насыще. ния фермента. Следует помнить, что, когда тритий используется в качестве метки только для того, чтобы проследить превращение субстрата в продукт, 'Н (в отличие от '4С) часто выделяется в среду в виде ионов 'Н4 в результате побочных спонтанных реакций, снижая тем самым удельную активность субстрата и продуктов и, следовательно, приводя к получению ошибочных данных о низкой ферментативной активности. В некоторых случаях побочные реакции катализируются ферментами и не всегда доходят до конца.
Кроме того, для меченных тритием соединений характерна «утечка» 'Н4 в результате какой-нибудь химической реакцив. Все зависит от положения 'Н в молекуле. Например, а-'Н-аминокислоты теряют 'Н в ходе многих реакций, катализируемых ферментами, тогда как атомы 'Н, расположенные в других, особенно в отдаленных от функциональных групп, позициях, относительно устойчивы.
Потеря трития может происходить также при выделении продукта. Некоторые определения ферментов основаны на освобождении 'Н из специфического положения в субстратс. Результаты анализа могут быть ошибочными, если 'Н находится не только в предполагаемом месте и (или) принимает неправильное стереоположение, так как многократно показано, что ферменты активируют тритий избирательно или специфически лишь в одном из двух нли более положений, занимаемых 'Н или Н.
Низкая энергия 'Н-радиации приводит к низкой эффективности счета и потерям вслсдствис тушения и поглощения излучения твердыми материалами. Эти два последних фактора в свою очередь обусловливают еще большую неточность измерений или даже получение ошибочных данных о более низких, чем на самом деле, скоростях ферментативных реакций.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
