Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 51
Текст из файла (страница 51)
Верхний буфер содержит бромтимоловый синий, для того чтобы можно было следить за перемещением границы. Затем подключают источник питания так, чтобы анод (положительный конец) был внизу. В течение первых 2 мин сила тока должна составлять 1 мА на 1 трубку, а затем 2— 5 мА на 1 трубку до тех пор, пока окрашенная полоса не окажется на расстоянии около 1 см от нижнего конца трубки. При падении напряжения в процессе электрофореза выделяется тепло, пропорциональное силе тока. Избыточное тепло приводит к образованию неровных полос.
Если в начале электрофореза температура системы была 20'С, то через 40 мин она повышается до 30 — 40'С. Температуру можно снизить, уменьшив силу тока, например, до 1 мА/гель при большей продолжительности электрофореза (140 мин). Однако в этом случае происходит некоторое расширение полос за счет диффузии Можно также проводить электрофорез прн 4'С, даже перемешивая при этом нижний электродный буфер. Разделяющие гели можно хранить в течение нескольких дней, но после добавления концентрирующего геля и исследуемого образца в стартовом геле электрофорез следует начать не позже, чем через 1 ч. Электродные буферы можно использовать многократно, но анодный н катодный буферы необходимо хранить отдельно. После нескольких анализов илн при изменении рН приготавливают свежие буферные растворы. Гели анализируют либо непосредственно в трубках, либо после извлечения из них.
Поскольку во время электрофореза проводимость геля изменяется, следует ожидать, что напряжение и ток также будут изменяться. Рекомендуется применять регулируемый источник тока, позволяющий поддерживать постоянную силу тока в течение всего процесса разделения. 264 ш Физические методы Если число трубок с гелем, подвергаемых одновременному электрофорезу, равно и, то сила тока должна в п раз превышать ее значение, выбранное для одной трубки; при этом во всех трубках должна быть одинаковая сила тока.
Это условие выполняется только в том случае, если площадь поперечного сечения и состав всех столбиков геля одинаковы. Электрофорез на пластинах Электрофоретическое разделение исследуемых веществ можно также осуществлять на пластинах полиакриламидного геля размерами 100Х100 мм при толщине слоя геля от 1 до 3,5 мм. Пластины с углублениями для внесения образцов приготавливают на особых подставках. Для проведения электрофореза требуется специальное оборудование.
Конструкция прибора позволяет устанавливать пластины в вертикальное положение; при этом канавки для образцов должны быть расположены у верхнего края пластины и контактировать с верхним буфером, тогда как противоположный край пластины должен находиться в контакте с нижним буфером. Необходимо обеспечить циркуляцию охлаждающей жидкости по поверхности пластины с обеих ее сторон. Основное достоинство этой системы заключается в том, что она позволяет проводить одновременное разделение нескольких образцов в одинаковых условиях, благодаря чему их легко можно сравнивать между собой. Считается, что пластины легче анализировать с помощью денситометра, однако для этого необходимо иметь специальный прибор. Кроме того, пластинки можно без особого труда разрезать на полоски и проанализировать их на наличие различных компонентов путем окрашивания илн определения радиоактивности.
Полоски можно также высушивать и хранить. Однако для приготовления пластин требуется больше акриламида, особенно если анализируется немного образцов. Как и в случае электрофореза в трубках, для данного метода разработан целый ряд однородных и неоднородных («прерывистых») буферных систем. Здесь применяются те же способы приготовления гелей, методики разделения н анализа, что и при электрофорезе в трубках.
ЧАСТЫЧ.МЕТАБОЛИЗМ Приготовление гелей Рассмотрим подробно приготовление одной из наиболее распространенных систем неоднородных («прерывистых») гелей. Описание многих других систем содержится в книге Мауэра 1661. Вследствие токсичности акриламида следует избегать вдыхания его распыленных частиц и попадания его на кожу. Концентрирующий и стартовый гели: 1 часть раствора А (25,6 мл НьрОь+5,7 г трнса на 100 мл) 2 части раствора Б (10 г акрнламнда+2,5 г )Ч,Х'-метнленбнсакрнламнла (БИС) на 100 мл) 1 часть раствора В (4 мг рнбофлавнна на 100 мл) 4 части раствора Г (40ь)ь-ный раствор сахаровы).
Разделяющий гель: 1 часть раствора Д (48 мл 1 н. НС1+36,6 г граса+023 мл )Ч,)ч,ы',М'-тетраметнл»тнленднамнна (ТЕА(ЭД) на 100 мл) 2 части раствора Е (30 г акрнламнда+0,8 г БИС на 100 мл) 1 часть воды 4 части раствора Ж (0,14 г нерсульфата аммония на 100 мл). Использование персульфата для полимеризации позволяет получать гели с различной пористостью и электрофоретическими свойствами.
Поэтому важно, чтобы полимеризация проходила при стандартных условиях. Персульфат может вызывать артефакты, которых легко избежать, если заменить персульфат рибофлавином н использовать фотолитическую полимеризацию вместо химической или применять восстанавливающие агенты, например тиогликолат (0,01 — 0,001 часть на 1 часть глнцина в буфере). С той же целью можно добавлять меркаптоэтанол (5 ММ) в концентрирующий и стартовый гели и в верхний буфер. Для удаления персульфата и других примесей иногда проводят предварительный электрофорез, но это нарушает прерывистость электрофоретической системы, превращая ее в однородную систему, что не всегда позволяет достичь нужного разрешения. При электрофорезе белков в состав геля можно включать ряд диссоциирующих агентов, например додецилсульфат натрия (см. ниже), дезоксихолат, тритон Х-!00 и мочевину. !б ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Электродные бункера! 0,6 г триса, 2,28 г гликина, 2 мл 0,00!с)б-ного отфильтрованного раствора бромтимолового синего (только лли верхнего буфера), рН 8,8.
В литературе описано много общих и специальных буферных систем, которые можно успешно использовать в качестве электродных буферов:[661. Чистота акриламнда и БИС играет важную роль в достижении хороших результатов, особенно при сканировании в Уф-свете белков и нуклеиновых кислот (см. ниже). Реактивы высокой степени чистоты имеются в продаже, или их можно приготовить в лаборатории 1661. Проба Проба должна по возможности иметь такой же состав буфера, рН и ионную силу, как и концентрирующий гель. Следует избегать применения растворов с высокой ионной силой. Если при разделении получается небольшое количество полос, то вполне достаточно, чтобы проба содержала от 5 до 50 мкг белка на 1 гель; полоса, содержащая 1 мкг белка, хорошо видна после окрашивания кумасси ярким синим.
Необходимо следить за тем, чтобы часть образца не перешла в электродный буфер. Анализ гелей Прямое денситометрическое определение. Анализируя результаты разделения белков и нуклеиновых кислот, часто упускают из вида возможность прямого сканирования гелей с помощью спектрофотометров. Этот метод отличается быстротой, позволяет проводить в процессе электрофореза повторное сканирование гелей через определенные промежутки времени для получения данных об электрофоретической подвижности исследуемых веществ и дает возможность избежать повреждения гелей при извлечении нх из трубок. Недостатки метода заключаются в том, что его чувствительность (по отношению к белкам) в 2 — 3 раза ниже по сравнению с методом окрашивання, а также в том, что он требует 267 ЧАСТЫМИ.
МЕТАБОЛИЗМ применения пропускающих УФ-свет трубок, чистых реактивов и точной настройки оптической системы, предназначенной для сканирования круглых на поперечном срезе цилиндрических гелей. Недорогие пропускающие УФ-свет трубки легко изготовить, нарезав алмазной пилой обычные трубки типа «Чусог» (Согп!пд О! азз %от)гз) с внутренним диаметром 5 мм на отрезкп нужной длины.
Отбирают трубки с одинаковыми оптическими характеристиками, рассматривая их на свет. Проблема оптической настройки для сканирования цилиндрических гелей одинакова в отношении как окрашенных, так и неокрашенных гелей. Существует несколько денситометров, обеспечивающих оптимальное сканирование таких гелей. Анализ гелей после извлечения их из трубок. Извлеченные из трубок гели можно сканировать, не подвергая их никакой дальнейшей обработке или после окрашивания.
Окрашенные гели можно также разрезать на сегменты и проанализировать материал, полученный путем элюирования. Кроме того, гели можно солюбилизировать, например для определения в них радиоактивности. Гели извлекают из трубок н окрашивают сразу же после электрофореза во избежание диффузии полос. Извлечение гелей связано с трудностями, и для того, чтобы успешно провести эту процедуру, не повредив поверхности гелей, необходим определенный опыт. Один из возможных способов заключается в том, что в пространство между стенкой трубки и гелем медленно вводят вращательным движением иглу шприца длиной около 8 см, выдавливая из шприца воду илн 50%-ный глицерин.
Иглу вынимают после того, как гель начинает свободно перемещаться в трубке или когда его можно вытеснить под давлением с помощью медицинской капельницы с грушей, заполненной водой. Это следует делать над лотком с водой или в самом лотке. Окрашивание. В большинстве случаев перед анализом гели окрашивают. При разделении белков обычно применяют амидовый черный 10В, процион яркий синий КЯ и кумасси яркий синий К250 (последний обладает особенно большой чувствительностью). В продаже имеется много других красителей 166! для белков, дезоксирийо- и рибонуклеиновых кислот. В литературе можно «б ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ найти описание всевозможных вариантов окрашивания и различных усовершенствований. Сообщается, что процион яркий синий дает более воспроизводимые результаты, чем кумасси яркий синий, при количественном анализе гелей с помощью денситометра [661.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
