Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Например, для стандартной ошибки в 1% требуется просчитать 10 000 нмп, для 2,5% — !600, для 5% — 400, а для 10% — 100. Как ведно из выражений, предстаат ленных ниже, при стандартной ошибке 1то для счета фое на потребуется 840 мин, а для счета образца и фона 1140 мин, тогда как при стандартной ошибке 10% эти цифры равны соответственно 8 и 11 мин. Статистические формулы 1. Среднее значение для нескольких измерений: Х вЂ” Сумма импульсов отдельных измерений (Х) Количество измерений (л) ЧАСТЬ 1Ч.
МЕТАБОЛИЗМ 2. Стандартное отклонение при нескольких циклах измерений: ((Сумма отклонений Х от Х)е~ е~ пе н — 1 3. Стандартнаяошибка скоростисчета 5Е (е7е) равна ВЕ— 100 Скорость счета (м) Время (1)Н' ' 4. Время, необходимое для получения результатов с данной стандартной ошибкой ВЕ (%): 1Ое )с(ЗВ%)е ' 5. Стандартная ошибка счета образца, когда времена счета образца и фона одинаковы: 5Е(%) = 100(х„„„— хе„) и х,„„„ — х, „ 6. Стандартная ошибка счета образца без счета фона, когда времена счета фона и образца не одинаковы: ВЕ(%) кнн()сед+ )сале)Ф %т — йь где И~ и т(е — суммарная скорость счета и скорость счета фона соответственно, а Т~ и Ть — времена для % и т(ь. 16.5.
ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ 16.5.1. Диск-электрофорез в геле Диск-электрофорез в его многочисленных вариантах, позволяющий проводить разделение макромолекул, стал в настоящее время очень важным методом, применяемым в биологических и медицинских исследованиях, а также в клинической диагностике и промышленности (для контроля за технологическими процессами).
С тех пор как в 1959 г. Орнстейн [671 и Дэвис [641 впервые описали метод «прерывистого» электрофореза, проводится широкое изучение всех аспектов гель-электрофореза, в результате чего был внесен большой вклад в разработку теории этого метода, получена подробная информация ис Физические методы об условиях его применения на практике, а также описано множество систем буферов и гелей [661. Здесь будет рассмотрена лишь одна из основных широко распространенных систем наряду с условиями ее использования, необходимыми для получения хороших результатов. Описаны также некоторые из главных областей применения диск-электрофореза.
Оби(ие сведения Электрофорез проводят либо в цилиндрических колонках, заполненных гелем (в стеклянных трубках), либо на пластинках размерами 10Х10 см, покрытых слоем геля толщиной 1 — 4 мм. Гель состоит из трех слоев: внизу располагается разделяющий гель, в середине— концентрирующий (гель-прокладка) и вверху — стартовый гель, содержащий образец. Каждый слой представляет собой полиакриламид с определенной степенью сшивки.
Гель образуется в трубке или на пластинке из раствора, содержащего акриламид (моиомер), М,М'-метиленбисакриламнд (БИС), буфер, сшивающий и полимеризующий агенты. Полимеризацию катализируют либо химическим способом, используя персульфат аммония, либо фотохимическим — с помощью света, который вызывает образование свободных радикалов в присутствии кислорода.
Разделение белков в прерывистой системе зависит от двух основных факторов: 1) различий в подвижности белков, обусловленных присущим поперечно-сшитым гелям молекулярно-ситовым эффектом, обеспечивающим разделение молекул в соответствии с их размерами, и 2) различий, связанных с зарядом молекул. Кроме того, необычно четкие зоны образуются благодаря концентрированию белков в виде очень узкой полосы или диска перед вхождением их в разделяющий гель.
Таким образом, величина молекулярно-ситового эффекта зависит от степени поперечной сшивки, которая в свою очередь определяется концентрацией сшивающего акриламида. Концентрирование белков в виде узкой полосы, перед тем как они входят в разделяющий гель, характерно для прерывистого электрофореза. Оно происходит в результате искусного использования неоднородного («преры- 259 ИАСТЬ !Ч.
МЕТАБОЛИЗМ вистого») ионного состава буферных растворов с разными значениями рН, а также неоднородных гелей с различными размерами пор во время прохождения белков через три слоя геля. Концентрирование белков обеспечивают, подбирая буферные растворы, содергкащие такую пару ионов и имеющие такие значения рН, чтобы подвижность одного иона (С1-), умноженная на степень его диссоциации, была больше произведения тех же величин для белка.
В свою очередь это произведение должно быть больше, чем соответствующая величина для второго иона (глицина) ~[661. Для выполнения этих условий на более длинный разделяющий гель с мелкими порами наслаивают концентрирующий гель с низкой степенью сшивки. Поверх концентрирующего геля помещают крупнопористый стартовый гель, содержащий образец (рис. 16.10).
Разделяющий гель готовят на более щелочном буфере с рН 8,9, тогда как концентрирующий и стартовый гели содержат буфер с рН 8,3. При наложении электрического поля белки быстро пересекают концентрирующий гель и образуют очень узкую полосу над разделяющим гелем, заключенную между хлорид- и глицииат-ионами. Затем белки медленно проникают в разделяющий гель. Скорость их перемещения в разделяющем геле зависит от заряда (обусловленного рН) и размеров молекул (благодаря тому, что гель имеет поры с фиксированными размерами и определенную степень поперечной сшивки). Поскольку перед разделением белков они концентрируются в очень узкой зоне, достигается чрезвычайно высокое разрешение. Например, сыворотка крови разделяется на 15 — 20 зон.
Сообщалось о разделении 62 компонентов сыворотки с помощью усовершенствованной системы для прерывистого электрофореза [81]. После окончания электрофореза гель можно анализировать путем сканирования в УФ-свете, не извлекая его из пробирки. Можно также проводить анализ с помощью УФ-сканирования или окрашивания после извлечения геля из пробирки. Согласно другому методу, гель разрезают на сегменты, которые затем вымачивают в растворе для элюирования содержащихся в них компонентов анализируемой смеси. Кроме того, при использовании меченых изотопов гели можно солюбилизировать н определить в них радиоактивность. Можно также в Б сз л ш й о за К Рис.
16.10, Слои геля и поведение ионов при диск-злектрофорезе в полиакриламидном геле. Л. Образец в геле. Б. Образец, сконцентрированный иа границе раздела между гелем-прокладкой н разделявшим гелем. В. Образец, разделенный на полосы в конце процесса. ЧАСТЫУ, МЕТАБОЛИЗМ разрезать гель в продольном направлении и после высушивания проанализировать его методом радиоавтографии. Колоночный метод [66] Для проведения электрофореза в колонках требуется очень простое оборудование, которое можно приобрести в готовом виде или изготовить в лаборатории.
В него входит водонепроницаемый держатель для одной или более стеклянных трубок длиной 65 — 70 мм и внутренним диаметром 5 мм. Конструкция системы такова, что наверху находятся буфер и электрод (катод), контактирующие с трубкой, заполненной гелем, а внизу находятся такой же буфер и анод (рис.
16.11). Трубки должны быть одного диаметра и иметь ровные края. Такие трубки можно изготовить в лаборатории или стеклодувной мастерской. Онн должны быть тщательно вымыты, перед сушкой их можно окунуть в неионный детергент (например, Кобан РЬо1о-Р!о). Первоначальная процедура заполнения трубок акриламидом, описанная Орнстейном [671 и Дэвисом [641, начиналась с полимеризации разделяющего геля в нижней части трубки. Позже была предложена методика ~[661, по которой разделяющий гель полимеризуется в верхней части трубки, так как при этом образуется более однородная граница раздела между концентрирующим и разделяющим гелями. Заполнение трубки проводят следующим образом.
В резиновый колпачок наливают 0,2 мл 407о-ного раствора сахаровы и плотно прижимают трубку к дну колпачка, для того чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Трубку устанавливают в вертикальное положение; затем готовят около 0,15 мл смеси для получения концентрирую щего геля (см. ниже) и с помощью небольшого шприца с иглой (длина 8 см, внутренний диаметр 0,6 — 0,8 мм) наслаивают эту смесь на раствор сахаровы. На поверхность концентрирующего геля осторожно наливают немного воды так, чтобы не произошло перемешнвания этих двух слоев и между ними образовалась резкая граница.
Высокое разрешение достигается в основном благодаря образованию четкой ровной границы между 262 1а. Физические методы концентрирующим и разделающим гелями. Полимернзацию геля вызывают облучением его флуоресцентной лампой в течение 20 — 30 мин ! с расстояния 2 — 3 см. После полимеризации слой воды осторожно и тщательно удаляют шприцем, а затем тампоном из неворсистого материала. Далее готовят разделяющий гель. Поверхность концентрирующего геля дважды быстро промывают смесью для получения разделяющего геля, а затем с помощью шприца заполняют трубку этой смесью так, чтобы получился выпуклый мениск, стараясь избежать образования пузырьков воздуха. Затем конец трубки плотно заклеивают полимер- )' ной пленкой.
Всю эту про- рне. галь простои нрнаор длн цедуру необходимо провести алектрофореза на колонке !— в течение б мин после обра- агаРоаы» гела, а — ауфеРныа зования концентрирующего геля. Как только полимеризацня закончится (через 30 — 40 мин), осторожно снимают колпачок, переворачивают трубку и аккуратно вставляют ее в резиновый колпачок нижним концом. Из другого конца, стан!пего теперь верхнич, удаляют раствор сахаровы и промывают поверхность концентрирующего геля смесью такого же состава. Затем наносят образец, включенный в смесь для приготовления стартового геля, и осторожно наливают электродный буфер до верхнего края трубки, пе допуская перемешивания двух слоев.
После этого проводят фотолиз стартового геля, как описано выше. Всю эту процедуру можно легко про- члсть ил мвтаволизм вести сразу в нескольких трубках, если заранее приготовить все необходимые растворы и если флуоресцентная лампа имеет достаточную длину. Трубки помещают в прибор и осторожно добавляют предварительно охлажденный электродный буфер в пространство сверху и снизу трубок (высота слоя нижнего буфера должна быть не меньше 4 см).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
