Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 46
Текст из файла (страница 46)
Этот процесс можно свести к минимуму, выполняя как можно точнее специальные указания фирм-изготовителей или одно из следующих более общих правил. Препараты радиоактивных соединений необходимо: 1) хранить при самой низкой практически возможной удельной активности; 2) разделять на отдельные более мелкие партии; 3) если данный препарат представляет собой твердое вещество, то его нужно хранить в сухом состоянии; 4) хранить в вакууме или в атмосфере инертного газа; часть гн. мгтлволизм 5) хранить в чистом бензоле при 5 — 10'С; 6) к водо- растворимым веществам, не растворяющимся в бензоле, добавлять этиловый спирт до концентрации 2 --10е)о,.
7) хранить при возможно более низкой температуре. Водные растворы 'Н-соединений не следует замораживать. Твердые вещества часто не требуется хранить под вакуумом или в атмосфере инертного газа, их можно держать в сухом состоянии в завинчивающихся флаконах. Ампулы с летучими материалами и жидкостями запаивают под вакуумом или в токе инертного газа. Методог изотопного разбавления Радиоактивные соединения можно использовать для определения количества тех же, но немеченых соединений, присутствующих в смеси с другими веществами.
Для этого необходимо знать удельную радиоактивность (УР) и количество добавленного в смесь радиоактивного соединения. Затем из смеси выделяют какую-то часть очищенного соединения и определяют его удельную радиоактивность. Содержание немеченого соединения в смеси рассчитывают по уравнению Количество немеченого соединения (г) = Количество добавленного У) нсхаан1я радиоактивного соединения (г) Х вЂ” !.
конечная Соединение считается чистым в том случае, когда удельная радиоактивность после нескольких повторных выделений препарата (или рекристаллизации) остается постоянной. С помощью обратного метода можно измерить общее количество содержащегося в смеси радиоактивного соединения. Для этого к пробе добавляют очищенное нерадиоактивное соединение, а затем его вновь выделяют.
Исходная удельная радиоактивность соединения и количество нерадиоактивного носителя должны быть известны, а конечную удельную радиоактивность определяют после выделения из смеси препарата. Количество радиоактивного материала рассчитывают по формуле. Количество неизвестного (радиоактивного) вещества (г) = Общее , У нечная количество (носитель плюс неизвестное вещество) (г)Х „ исходная 23з ге. физичпскиа мвтоды Метод двойного изотопного разбавления с успехом используется для выделения очень малых количеств веществ, например для извлечения стерола из какого-нибудь гомогената с помощью многоэтапной процедуры, прггводяпгей лишь к частичному выходу очищенного соединения. К гомогенату можно добавить "С-стерол с известной общей радиоактивностью.
Выход стерола на последнем этапе очистки определяется по общей "С-радиоактивности выделенного очищенного соединения. Согласно другой методике, получают какое-либо производное стерола, проводя соответствующую реакцию либо в неочищенном экстракте, если это удобно, либо на одном из самых ранних этапов очистки. Например, для получения ацетилового эфира стерола можно использовать уксусный ангидрид, меченный 'Н. По содержанию 'Н в выделенном материале определяют исходное количество стерола. Для этого необходимо знать только удельную радиоактивность уксусного ангидрида.
Итак, Радноактне "ость иы деленного стерола (имп/мин) Выход стерола ™ Радиоактивность добавленного стерола (имп/мнн)' Количества еН соединения (мкмоль) Количество стерола (мкмоль)= Выход Радиоактивность аН-соединения (имп/мин)/Эффектинность счета УР уксусного ангидрида (мкКи!мкмоль) Выход 1 мкКи = 2,22 1Ое расп./мин. Определение необходимого количества радиоизотопа Как правило, суммарная радиоактивность должна в умеренной степени (вдвое) превышать минимум, необходимый для определения конечной или самой низкой активности образцов. Это позволяет избежать вредного влияния радиации и загрязнения лабораторного оборудования, а также максимально повысить уровень безопасности при проведении экспериментов. Проще всего, естественно, при расчетах исходить из радиоактивности, указанной в опубликованных работах, в которых описаны подобные эксперименты, внеся в эти расчеты соответствующие поправки на изменение объемов, характери- ЧАСТЬ Ш, МЕТАБОЛИЗМ стик приборов и т.
д. Если это невозможно, следует начать с минимальной скорости счета, дающей удовлетворительные результаты (равд. 16.4.4), Затем на основе полученных данных рассчитывают необходимое общее количество активности (число распадов в 1 мин). В расчетах следует учитывать многие из перечисленных ниже факторов: период полураспада изотопа, длительность эксперимента, исходный объем образца, коэффициент разбавления, эффективность счета, молярную удельную активность, объем анализируемого образца, период биологического полураспада соединения, потери вещества при выделении, чистоту и устойчивость, а также метаболические превращения меченого соединения.
Представим, что необходимо выделить на колонке меченный тритием метаболнт, полученный прн ннкубнровании глюкозы в 'Н,О. Материал, элюирующийся из колонки, распределяется в пяти фракциях по 1О мл и содержит один атом 'Н на одну молекулу метаболнта. Выход метаболита в расчете на глюкозу, добавленную после разделения, составляет 5% при учете всех факторов, влияющих на образование метаболических пулов, а также побочных реакций и потерь при выделении. Для выделении метаболита используют половину всей инкубационной смеси, В этом эксперименте выделенный материал содержит изотоп 'Н, включенный в него из молекул Н,О. В процессе включения протоны весьма успешно конкурируют с 'Н~ благодаря их значительному численному превосходству, а также изотопному эффекту, обусловленному различиями в массах и химических характеристиках протонов и ионов 'Нг.
Допустим, что этот эффект для протона в 4 раза больше, чем для 'Н~. Чтобы получить хорошие результаты при подсчете импульсов, раствор, в котором проводится измерение радиоактивности, должен содержать не более 0,5 мл растворенного в воде образца. В нашем примере раствор бтдет содержать 0,2 мл образца. Эффективность счета для 'Н равна 43%, при этом тушение составляет 20%. Ииогда эффективностью счета называют сумму этих двух величин. Для МС и 'Н не требуется вносить поправки на распад радиоактивности.
!ь Физические метОды Учитывая, что при измерении радиоактивности может быть допущена ошибка в счете (см. ниже), подсчитаем 5000 распадов. Поскольку сцинтилляцпонный счетчик может работать непрерывно не более 1 — 2 ч, для получения такого счета необходимо затратить по 1О мин на образец. Таким образом, образец объемом 0,2 мл должен содержать радиоактивность, соответствующую 500 имп/мин для фракции с самой низкой активностью. Можно подсчитать, что доля общей радиоактивности, распределенной по пяти фракциям, составляет в каждой из них 5, 20, 50, 20 н 5%. Следовательно, скорость счета для каждого образца объемом 0,2 мл должна быть равна 500, 2000, 5000, 2000 и 500 имп/мин или 8000 имп/мин для всех пяти образцов, взятых из элюата объемом 50 мл.
Продолжим наши расчеты: 8000 имп/ /мип 50 (общий объем образца) .2 (общий объем реакционной смеси) —:0,43 (эффективность счета) —:0,8 (тушение) 4 (изотопный эффект) —:0,05 (выход) =1,86 10" раси./мин 'НГО, которую необходимо добавить к реакционной смеси. Имеющаяся в продаже 'Н,О содержит 25 мКи/мл или 25 МКИ 2,22 10' (расп./мин/МКи) =5,55Х 1,50 1О" Х 10 раси /МИН/мл ОСНОВНОГО раСТВО)за: 5 55 11м 5 55 1Ом =0,00335 мл (3,35 мкл). Лучше взять 3,35 мл основного раствора 'НтО и развести его в 1000 раз.
Таким образом, подсчет общей радиоактивности дает информацию о необходимых количествах используемых веществ. Однако следует рассчитать также и удельную активность, т. е. число распадов в 1 мин па 1 моль или 1 мкмоль вещества, для того чтобы определить число участвующих в нзотопном обмене атомов трития или выяснить, вовлечены ли в уравновешивание с атомами водорода какие-то другие процессы. В приведенном выше примере было установлено, что в 1 мл или в 55,56 ммолях воды либо в 111 мэкв.
водорода, содержащихся в 1 мл, происходит 5,55 10" расп./мин. Удельная 5 55,10м активность равна —,',—,, нли 5.10', раси./мин/мэкв. Н. Находим коэффициент разбавления удельной активности 1О мл при инкубнровании 10 мл реакционной смеси:О 0335 О, 00335 мл ЗЫ 34! ЧАСТЬ |Ч МЕТАБОЛИЗМ =2,985, что дает удельную активность 5 10"/2,985= =1,67.!0' расп./мин/мэкв. Н. Если выделенный метаболит имел такую удельную активность, то, значит, в него был включен ! экв. 'Не прн изотопном эффекте, равном 4.
Если удельная радиоактивность выше или ниже этого значения, то величина изотопного эффекта должна быть другой, при этом в изотопном обмене могут участвовать атомы водорода не только из 'Н,О (более низкая удельная активность) или в молекулу метаболита включается более чем один протон из 'Н,О (более высокая удельная активность). У трития изотопный эффект имеет значительную величину, тогда как у "С, з'Р и з53 оп настолько низок, что его можно не принимать во внимание. Часто бывает необходимо проводить независимое определение изотопного эффекта, измеряя скорость реакции с Н,О (или 'Н,О) и с 'Н,О. Исследование трерментов с помощью изотопов Разработаны многочисленные методики определения ферментов с использованием радиоизотопов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
