Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 43
Текст из файла (страница 43)
Это обусловлено тем, что такие молекулы связываются с матрицей в результате адсорбции, ионного обмена с небольшим количеством присутствующих в матрице карбоксильных групп или взаимодействия между ароматическими кольцами и матрицей. Таким образом, общий объем колонки 1', равен сумме свободного объема Чы внутреннего объема 1', и объема матрицы или гранул У«'. )т, = У,+К+)т„.
Материалы для гель-фильтрации Существует по меныпей мере четыре вида гранулированных гелей: поперечно-связанные декстраны и их производные, полиакриламиды, атаровы и поперечносвязанные атаровы и стиролдивннилбензольные сополимеры. Размеры гранул и степень их пористостн могут быть различными; только две фирмы выпускают 180 различных видов гелей. Перечисление всех характеристик этих гелей не входит в нашу задачу, поэтому более подробную информацию можно найти в брошюрах, выпускаемых фирмами.
К тому же в них содержится много сведений общего характера. м лизичвсхив мвтоды Многокомпонентный анализ Правильно подобрав пористость гранул и тщательно разработав экспериментальные условия, можно разделить очень сходные молекулы или, наоборот, молекулы, относящиеся к совершенно разным классам. Особенно трудно разделить смесь различных веществ, но в этих ус. ловиях не так важна высокая скорость потока. Поскольку на небольших колонках обычно получают количественные выходы, после разделения компонентов на не.
перекрывающиеся пики их можно подвергнуть количественному анализу с помощью неспецифических методов. Таким путем можно разделить, а затем обессолить на сефадексе 6-15 ряд простых сахаров, например рафинозу, мальтозу и глюкозу 1281, Такое разделение основано, как правило, на различиях в молекулярных массах анализируемых веществ, Однако иногда оно обусловлено и другими причинами, вызывающими задержи- ванне определенных молекул в колонке, например адсорбцисй полярного растворенного вещества из нсполярного растворителя. Определение константы равновесия По количеству лиганда, обратимо или необратимо связанного с неизвестным количеством высокомолекулярного вещества, можно рассчитать их константу равновесия или стехиометрию связывания 141~ (рис.
16.7). Лля этого проводят инкубирование данного вещества и лиганда с последующей гель-фильтрацией на сефадексе 6-50, причем уравновешиванне и элюцию осуществляют с помощью раствора с такой же концентрацией лиганда, которая использовалась в эксперименте по связыванию. При элюироваиии концентрация лигаида в пикс белка оказывается выше, чем в элюирующем буфере, за счет связывания лиганда с белком, который в этот момент находится в элюате. На участке кривой элюции, соответствующем общему, или «солевому», объему элюата, образуется впадина. Здесь находится исходная инкубационная смесь, из которой удален лиганд, связавшийся с уже вышедшим из колонки белком. Площадь впадины равна площади пика.
Определив количество лиганда, исходя из суммы площадей этих пиков, ЧАСТЬ 1М МЕТАБОЛИЗМ Рис. 1б.7. Схема элюпни для определения равновесного свяэывання лнганда с белком. обеем элса,па можно рассчитать соответствующую константу равновесия или стехнометрию связывания, если оно очень прочное. Хроматографироваиие на колонке (40эг',2 см) с крупно- или мелкогранулироваиным сефадексом Сг-50 весьма эффективно. На рис. 16.7 изображена взятая из работы Хаммела и Дрейера [41) кривая элюирования, полученная на колонке с крупногранулированным сефадексом Сг-25 (0,4Х!0 см); объем пробы составлял 0,25 мл, а скорость элюирования — О,З мл/мин.
Значения уо и уг+)го определяют с помощью декстрана синего и феррицианида соответственно, для того чтобы рассчитать объем элюата, разделяющий два пика. Объем пробы можно увеличить так, чтобы первый пик занимал весь участок кривой между двумя пиками, Однако вниду размывания пиков следует использовать не более 66% максимального объема пробы. Например, при разделении па колонке размерами 5Х50,8 см КС! и альбумина объем пробы может быть равен ЗО мл, в процессе элюции проба разводится в 5 раз, а между пиками выходит большой обьем злюата. Такое же разделение можно получить при объеме пробы 300 мл и ее разведении в 1,5 раза.
В качестве элюата используют воду или буфер. Следует отметить, что эта процедура применяется для удаления молекул малых размеров после химической обработки белков (например, растворимых флуорссцнрующих реактивов) и для замены одного буфера другим. В последнем случае используется «обессоливающаяв колонка, уравновешенная н промытая новым буфером, который служит также и злюентом. 224 )О. Физические методы Фракционирование белков и определение молекулярной масссч При проведении гель-фильтрации в препаратнвном масштабе, например прн очистке ферментов н антител, часто приходится идти на компромисс, выбирая между высокой степенью разрешения и большой скоростью потока.
Таким образом, хорошее разделение в какой-то мере приносится в жертву прн использовании более крупных частиц геля, позволяющих быстрее пропускать через колонку нужный объем жидкости. Пористость частиц должна быть подобрана (часто эмпирически) так, чтобы можно было разделить как можно больше компонентов и чтобы на кривой элюнрования нужный компонент располагался между Уе н Уз+ Ус Для этого успешно применяется либо только одна гель-фильтрация, либо гель-фильтрация в сочетании с другими способами разделения.
Молекулярную массу растворимых белков можно определять с помощью гель-фильтрации на сефадексах 6-75 и б-100 [30, 50). Для этого строят график линейной зависимости отношения У,/Ур, где У, — объем пика неизвестного компоненте, а Уе — свободный объем, от логарифма молекулярной массы ряда ферментов и белков с известными молекулярными массами. Молекулярную массу неизвестного компонента находят по графику.
Этот очень полезный метод в основном вытеснен сейчас другим, более быстрым и удобным методом дискэлектрофореза в геле (разд. 16.5.1). Концентрирование Существует очень простой способ концентрирования растворов высокомолекулярных веществ, не сопровождающегося изменением рН или ионной силы. Для этого к раствору добавляют сухой крупногранулярный сефадекс С|-25, Через 10 или более минут исключенную фракцию отделяют путем центрифугирования в центрифуге с подвесными стаканами или с центрифужнымн пробирками, снабженными специальными вкладышами с фильтрами. 225 чАстыъ'. Ме1Аьолизм Выбор материала для гель-грильтрации Материал для гель-фильтрации должен иметь интервал фракционирования, соответствующий данной цели. Для полного исключения исследуемого вещества используют гель с интервалом фракционировання, верхний предел которогозначительно ниже, чем молекулярная масса этого вещества, например, для исключения большинства белков применяют сефадекс П-25 (интервал фракционирования для молекулярных масс от 100 до 5000), а для веществ с молекулярной массой выше 3000 — сефадекс П-10 (интервал фракционирования для молекулярных масс от 0 до 1500).
Для полного уравновешивания анализируемого соединения с жидкостью во внутреннем объеме геля ((г,) и последующего элюирования его с «солевым» объемом ((ть+ (г~) выбиРают гель с интеРвалом фракционирования, нижний предел которого превышает молекулярную массу данного соединения. Прн фракционировании вещества (или веществ) гель должен иметь такой интервал фракционирования, при котором это вещество (нли вещества) элюировалось бы с некоторой задержкой, например, для фракционипования сывороточных белков используют сефадекс б-200 (предел исключения 200000), а для определения их молекулярных масс — биогель А, 0,5 М (предел исключения 500000). Степень разрешения зависит главным образом от скорости потока, которая в свою очередь связана с размером и однородностью гранул.
Наивысшая степень разрешения достигается при использовании очень мелких гранул и низкой скорости потока. В случае биогелей Р и А для получения максимально возможной степени разрешения необходима скорость потока 2— 10 мл)ч на 1 см' поперечного сечения слоя гранул, что намного ниже максимальной скорости свободного истечения жидкости для некоторых других гелей, Применение наиболее пористых гелей, например биогелей А50 и 150 М (200 †4 меш), требует повышенного гидростатического давления.
При использовании биогелей Р-2, Р-4 и Р-6 (400 меш), обеспечивающих разделение малых молекул с высоким разрешением, давление можно 226 м Физические методы повысить до нескольких атмосфер. Величина максимально возможного давления указана в брошюрах, выпускаемых фирмами-изготовителями При использовании некоторых высокопористых материалов разрушение структуры гранул приводит к сильному снижению скорости потока. При получении биологических материалов редко создаются такие химические условия, которые могли бы вызвать разрушение матрицы геля.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
