Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 39
Текст из файла (страница 39)
Оснбвная окись алюминия (рН !Π— 10,5) обладает такими же свойствами в отношении соединений, адсорбируемых из органических растворителей. Однако в водной среде она действует как сильный катионообменник, сорбирующий оснбвные соединения, например аминокислоты и амины. Промытая кислотой окись алюминия (рН 3,5 — 4,5) действует как анионообменник в водной среде. Для очистки макромолекул в водных растворах используются такие адсорбенты, как окись алюминия, С», кальций-фосфатный гель и гидроксиапатит.
Они хранятся в виде концентри- 202 м Физичгскив методы рованных суспензнй, которые не очень пригодны для колоночной хроматографии, хотя для гидроксиапатита описаны такие методы 145). Разделение белков Периодический процесс разделения белков осуществляют путем их адсорбции и последующего элюирования.
Условия проведения такой процедуры следует установить в ходе контрольных опытов с каждой партией адсорбента и обычно с каждым препаратом белка (фермента или антитела), предназначенным для разделения. На рвс. 16.6 представлены результаты проведения циклов адсорбции и элюирования, полученные в контрольных опытах. На рис. 16.6, Л показаны три процесса адсорбции, различающиеся в зависимости от природы очищаемого материала, примесей и других параметров, например рН и ионной силы. Интересуюший нас белок может адсорбировазься лучше, чем белки-примеси (слева), так же, как они (в центре), или хуже (справа).
В первом случае к раствору добавляют такое количество адсорбента, какое необходимо для извлечения основной части нужного вещества, при этом большинство других белков остается в растворе (положительная адсорбция), Если нужный белок адсорбируется хуже примесей, то адсорбент добавляют, а затем удаляют до тех пор, пока не начнется адсорбция нужного белка (количество адсорбированного белка должно составлять около 10%). В этом случае вначале удаляются белки-примеси (отрицательная адсорбция), после чего нужный частично очигценный материал можно адсорбировать или очистить каким-либо иным способом.
Если примесный и основной белки адсорбируются с одинаковой скоростью, адсорбция можст привести лишь к небольшой степени очистки. Тем не менее можно добиться положительных результатов, подвергнув очигцаемый белок последова1ельным циклам адсорбции и элюции, На рис. 16.6, Б показаны три тина элюции. Нужные вещества могут элюироваться раньше, чем белковые примеси (слева), одновременно с ними (в центре) или после них (справа), Если очищаемый материал элюируется раньше, адсорбент следует обрабатывать ограни- члстыи атитлиолизм 4. Цикл ибсорбиии б. Цикл элкктои 1 1 и З Яе а ч Адсорбенео — э Услобия злюиообония Рис. 16.6. Использование адсорбцви и злюции для очистки ферментов (Объяснения в тексте,) 204 я.ензичаскив методы ченным объемом элюента или проводить элюирование циклами для удаления большей часги адсорбированного материала, оставляя примеси на адсорбенте.
Если вначале элюируются другие белки, адсорбент следует обрабатывать элюентом с возрастающей ионной силой, изменяя рН или сохраняя его прежним до тех пор, пока в элюате не появится значительное количество нужного вещества. Затем условия элюирования изменяюг так, чтобы элюировались нужные вещества. Очевидно, что если при адсорбцин и элюировании не наблюдается различий в поведении основного вещества и примесей, следует либо заменить данную методику, либо подобрать новые условия. В такой работе используется главным образом чисто эмпирический подход.
Однако график, построенный на основании небольших контрольных опытов, демонстрирующих поведение нужного вещества и примесей, служит хорошим подспорьем при разработке общей методики. Обычно повышение ионной силы и изменение рН в сторону изоэлектрнческой точки белка приводят к усилению элюирующей способности элюента. Кроме того, субстраты, эффекторы и другие лиганды, связывающие ферменты и другие белки, часто действуют как специфические элюирующие агенты. Разделение липидов (см. равд. 17.3.3.) Разделение фосфолипидов с помощью тонкослойной хроматографии описано в равд.
17.3.4. 16.3.3. Жидкостно-жидкостная распределительная хроматография В двухфазной системе растворителей смесь веществ, частично растворимых в каждом из этих растворителей, после достижения равновесия распределяется между двумя фазами в соответствии с их растворимостью в каждой из фаз. На основе этого явления разработаны полезные методики периодической и непрерывной экстракции различных веществ. Экстракторы для противо- точного распределения Крейга и Подбильняка — примеры наиболее удачных аппаратов такого типа.
Однако 205 часть пл матхво.пизм возможность разделения сходных веществ с помощью этого метода ограничивается числом циклов распределенвя, которые можно осуществить. К счастью, когда одна фаза двухфазной системы иммобилизована в виде слоя, находящегося на поверхности малых частиц, процесс распределения может многократно повторяться прн использовании хроматографии в колонке, заполненной порошком целлюлозы, или на бумаге. При этом венгества разделяются в результате распределения их между водной фазой, покрывающей целлюлозные волокна, и неполярной фазой, протекающей через пространство между волокнами.
Кремневая кислота или целит также широко используются в качестве носителей при распределительной хроматографии как в колонках, так и в тонком слое. Разделение веществ с помощью кремневой кислоты в колонках описано в разд. 18.5.2, а в тонком слое — в разд. 17.3.4. Газовая хроматография (разд. 16.3.4) и некоторые виды жидкостной хроматографии под высоким давлением (разд, 16.3.5) также основаны на распределении растворенных веществ.
16.3.4. Газожидкостная распределительная хроматография Один из наиболее универсальных методов разделения, идентификации и количественного определения биологически важных соединений основан на распределе. нии летучих растворенных веществ между подвижной фазой — газом-носителем — и жидкой фазой, нанесенной на инертные частицы.
В принципе с помощью этого метода можно анализировать любое соединение, которое становится летучим или может быть превращено в летучее соединение при температуре до 375'С. Поэтому газожидкостная хроматография (ГЖХ) нашла широкое применение в бактериологии, особенно прн исследовании компонентов клетки, в качестве вспомогательного средства при классификации и как способ количественного определения продуктов метаболизма. Метод отличается высокой чувствительностью и во многих случаях точностью и воспроизводимостью.
При этом достигается исключительно высокое разрешение, особенно прп использовании капиллярных колонок. Однако для реали- 206 М.ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ зации всех возможностей этого метода требуется отно. сительно сложное оборудование и некоторый опыт. Газожидкостной распределительной хроматографии посвящено много теоретических исследований, результаты которых позволяют заранее предсказывать условия, необходимые для разделения и количественного определения веществ. При использовании этого метода приходится иметь дело с большим числом переменных, включая тип и размеры частиц-носителей, природу и состав жидких фаз, размеры колонок и их конструкцию, природу газа-носителя и скорость его прохождения через колонку, температуру колонки и ее программирование, чувствительность и избирательность детектора. Манипулирование этими переменными обеспечивает гибкость метода и возможность приспособления его к изучению различных проблем бактериологии, однако подробное их обсуждение выходит за рамки данного руководства.
Подробное описание применения ГЖХ в бактериологии можно найти в работе Митруки ~261. В последующих разделах даются лишь общий обзор этого метода н две прописи, пригодные для классификации и анализа продуктов метаболизма. Принцип метода Газ, содержащий летучее вещество, пропускают через длинную трубку, заполненную частицами инертного материала, покрытого полярным или неполярным веще- "твом, которое находится в жидком состоянии при рабочих температурах. Псследуемое вещество распределяется между газовой и жидкой фазами.
Хотя между ними не достигается равновесия, распределение вещества зависит от его относительной растворимости в этих фазах. Зона растворенного вещества движется через колонку со скоростью, отражающей его растворимость в жидкой фазе. Вещества с более низкой растворимостью движутся быстрее, чем с более высокой. Зоны выходят из колонки, распределившись в виде приблизительно симметричных ников (в зависимости от условий) в соответствии со значениями их коэффициентов распределения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
