Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Это происходит в результате изменений интенсивности возбуждающего света, обусловленных высокой оптической плотностью измеряемого раствора при длине волны возбуждения. Поэтому оптическая плотность ие должна превышать 0,2 и независимые измерения оптической плотности стандартных растворов и исследуемых образцов следует проводить при длинах волн возбуждения и излучения. Флуоресценция примесей Нижний предел чувствительности определяется флуоресценцией фола, которая снижается до минимума при использовании чистых реактивов.
Кроме того, ошибки могут возникать из-за неодинакового загрязнения образцов и стеклянной посуды различнымн флуоресцирующими материалами, в том числе резиной, жирами, отпечатками пальцев и экстрактами из фильтровальной бумаги или диализпой трубки. Мутность также увеличивает вероятность ошибки из-за рассеяния света, измеряемого как флуоресценцпя. Таким образом, стеклянную 160 м Физнчвския мйтоды посуду, в которой проводятся измерения и хранятся растворы, необходимо содержать в абсолютной чистоте.
Многие нз упомянутых выше эффектов можно свести к минимуму, применяя защитные фильтры перед фотоумножителями. Порча образцов и д'ругие артефакты Образцы могут портиться до нли во время измерения. Довольно часто происходит фотохимическое разложение исследуемых соединений н нх адсорбция на стеклянных поверхностях, что особенно касается макромолекул. Первое нз этих двух явлений может проявляться в виде ослабления флуоресценции с течением времени, а о наличии второго свидетельствует явное запаздывание изменения флуоресценции прн увеличении концентрации образца или флуорофора.
Влияние температуры Поскольку явления, связанные с флуоресценцией, зависят от температуры, все измерения следует проводить при постоянной температуре, предпочтительно в термостатируемой кювете. 16.2. ИОНСЕЛЕКТИВНЫЕ ЭЛЕКТРОДЫ Уравнение Нернста Е=Е + — !и — ' йт 10х,) О ат" (й Ц можно применять при измерении концентрации (активности) или отношения концентраций некоторых молекул илн ионов, Š— измеряемый потенциал, Ее — стандартный потенциал электрода, )к=8,314 Дж/(моль К), Т— абсолютная температура, и†число электронов, т"= =96500 Кл/(г-экв.), а (Ох.) и [йеб.1 — концентрации соответственно окисленных и восстановленных форм вещества.
Это фундаментальное уравнение электрохимии дает возможность определять ряд биологически важных ионов, например водорода, кислорода, аммония, хлора и многих других веществ. Использование данного уравнения прн разработке прибора предполагает наличие в нем: 1) измерительного электрода, способного улавли- !81 ЧАСТЬ Ил МЕТАБОЛИЗМ вать потенциал, создаваемый окислительно-восстановительной парой, 2) стандартного полуэлемента с известным потенциалом и 3) электрометра илп потенциометра, измеряющего напряжение между двумя полуэлементами.
Решение уравнения Нернста для измеряющего полуэлемента вытекает из отношения Е (измеряющий полуэлемент) =Е+ Е,. Возможность определять тот или иной ион зависит от конструкции измеряющего электрода. Например, стеклянный электрод создает потенциал, пропорциональный концентрации ионов водорода, а некоторые ионселективные электроды создают потенциалы для специфических ионов, так как мембрана или твердый материал, изолирующий металлический электрод от среды, является ионселективным.
Существует много других подходов к определению концентрации различных ионов, основанных на свойствах электродов. Например, измерение кислорода с помощью электрода представляет собой один из видов полярографии, поскольку для ионнзации кислорода необходимо поляризующее напряжение. 16.2.1. Электрод для измерения ионов водорода Стеклянный электрод является практически единственным средством измерения активности водородных ионов. Тонкая мембрана из специального стекла отделяет хлорсеребряный полуэлемент от измеряемого раствора 111). Электрический потенциал стеклянного электрода изменяется линейно в зависимости от рН в широком диапазоне значений рН вЂ” от 1 до 11. В области рН 11 и выше линейность показаний наблюдается только в том случае, если применяется специальное устойчивое к щелочи стекло.
В качестве электрода сравнения используют стандартный каломельный (НдзС(э) полуэлемент, соединенный с измеряемым раствором с помощью соленого мостика (КС1). Оба электрода — стеклянный и стандартный — погружают в раствор образца или объединяют их в один комбинированный электрод, который можно вводить в длинные пробирки или приспособить для измерения очень малых объемов образцов. 182 !а. Физические методы Калибровка ДН-метра Прибор следует откалибровать с помо!цыо буферных растворов с известными значениями рН. Для этой цели часто применяют готовые жидкие илн твердые буферы с указанными на упаковках величинами рН, однако такой дорогостоящий и отнюдь не лучший способ калибровки использовать вовсе не обязательно.
В табл. 16.1 приведены некоторые стандартные буферы 1101, имеющие надежные значения рН. Если электрод дает линейные показания, то для калибровки прибора в пределах нужного диапазона рН можно использовать один стандартный буфер. Однако поведение электрода редко бывает идеальным, поэтому целесообразно использовать два стандартных буфера (например, с рН 4,00 и 6,88), установив тем самым соответствующий диапазон рН измеряемых растворов.
Таблица 16.1. Значения рн стандартных буферов нрн 20'С [61 Буфер ри рн Буфер 1,!О 2,16 0,1 М Ь!С! 0,01 М тетраоксалат калия 0,05 М фталат калия 0,025 М КНгРОг+ +0,025 М !Чаг!1РОг 0,01 М бура 0,025 М !Ча11СОг+ +0,025 М !ЧагСОг 9,22 10,02 4,00 184 Кроме статического определения рН образцов рН- метр или его автоматический вариант (р1-1-стат) позволяет следить за ходом реакций, в которых участвует нли потребляется ион водорода. В этом случае для поддержания постоянного рН добавляют щелочь или кисло. ту; кривая потребления кислоты или щелочи, отложенного против значений времени, отражает развитие рсакции. Фермеитативиое или химическое окисление глюкозы или глюкозо-б-фосфата, фосфорилирование субстратов прн участи аденозинтрифосфатов и соответствующих киназ, а также гидролиз белков протеазами — все это примеры реакций, которые можно проследить с помощью стеклянного электрода.
ЧАСТЬ ИЛ МЕТАБОЛИЗМ Некоторые трудности Основные трудности, возникающие при измерении рН, обусловлены нелинейностью показаний в щелочной области, поглощением СО, нейтральными и щелочными пробами и стандартными растворами, а также постепенным испарением стандартных растворов. Большинство проблем, связанных с неудовлетворительной работой прибора, объясняется плохим содержанием электродов. Для точного н воспроизводимого измерения рН с помощью стеклянного электрода необходимо, чтобы на нем присутствовал уравновешенный слой геля, Фирмы- изготовители рекомендуют новый илп уже промытый электрод выдсрживать в течение нескольких дней в воде или сначала в буферном растворе, а затем в воде для образования на нем слоя геля; рекомендуется также между измерениями помешать электроды в дистиллированную воду. После использования электроды промывают и вытирают для удаления прилипших материалов.
К сожалению, недостаточная очистка электродов н их хранение в воде приводят к загрязнению стеклянной поверхности. Лнпиды и белки, прилипшие к стеклу, обусловливают нелинейные показания электрода н замел- ленную ответную реакцию прибора. Кроме того, на электроде может происходить рост бактерий, что также вызывает загрязнение стеклянной поверхности электрода и закупорку асбестовых волокон, служащих соленым мостиком между стандартным электродом и измеряемым раствором. В каломельном электроде следует поддерживать достаточно высокий уровень раствора КС1; во время измерений пробку необходимо убирать, для того чтобы раствор КС1, вытекающий через асбестовое волокно, предотвращал его загрязнение примесями, Если стеклянный электрод загрязнен, естественно возникает желание заменить его новым.
Однако старый электрод можно хорошо очистить, помешая его несколько раз попеременно в 0,1 н. растворы НС1 и ЯЗОН при 50'С. Затем электрод вымачивают в воде, чтобы восстановить нарушенный слой геля. В трудных случаях реко. мендуется погружать электроды сначала на несколько секунд в 10'4-ный раствор НР, а затем в 5 н. НС1, после чего их вымачивают в дистиллированной воде. 184 1Б. Физичяскиа матоды Влияние солей Измерение рН прн высокой ионной силе измеряемого раствора приводит к ошибкам, достигающим 0,5 единицы рН.
С этой проблемой часто сталкиваются при приготовлении высокомолярных растворов сульфата аммония, имеющих нейтральный или щелочной рН, Обычно перед измерением рН таких растворов их разбавляют в соотношении 1: 20. Разбавление растворов полностью диссоциированных солей мало влияет на рН, так как соотношение ионов остается почти постоянным. При определенных обстоятельствах степень влияния солей проверяют с помощью стандартов, приготовленных с использованием исследуемых растворов солей. 16.2.2. Другие ионселективные электроды Таблица 1ббп Некоторые иоиселективиые электроды, ирнмеияемые н бактериологии 181 Гааочувствн- тельные Твердые Стеклянные жндкостные мембранные Галоиды, 8, СОа, МНа, ЗО~в- 80, ХО, н,з, нс)ч Вг-, 1-, 1ЧОв-, СОа', ЯОьв-, К+, Са'+, РОь'-, органические вещества Н+, одиовалеитт иые катионы 186 Существуют ионселективные электроды, предназначенные для электрометрического определения различных ионов и газов 181.
Большинство таких электродов находит применение в промышленных процессах, однако некоторые из них позволяют определять биологически важные ионы с достаточно высокой чувствительностью н избирательностью, чтобы их можно было использовать в бактериологических исследованиях. Ионселективные мембранные датчики делятся на четыре типа: стеклянные, твердые (или осадочные), газочувствительные н жидкостные (табл. 16.2). Ответная реакция электрода — это в широком смысле результат ионообменного процесса, причем возникающие потенциалы подчиняют- ЧАСТЬ Щ.
МЕТАБОЛИЗМ ся уравнению Нернста или одной яз его более развернутых форм. В аммиачном электроде имеется газопропицаемая мембрана 1!4), сквозь которую диффундирует аммиак, вступающий в реакцию с заполняющим раствором". ХНЗ + Н О = Хна + ОН . Концентрацию гпдроксида в заполняющем растворе определяют затем с помогцью электрода сравнения. Описываемый электрод специфичен по отношению к аммиаку; он позволяет определять также и ионы аммония после добавления к раствору ХаОН до рН 11. Определению мешают только летучие амины. Использование электрода фирмы ОПоп Со.
дает возможность определять аммиак в концентрации от 17 мкг до 17 мг на 1 мл с точностью 2о7р или вьппе. Нитраты н нптриты также можно измерить после их восстановления, а азот, определяемый по Кьельдалю, — после сжигания пробы и добавления к ней ХаОН (разд. 20.2.7). Для измерения азота мочевины необходимо иметь модифицированный аммиачный электрод, в котором вторая мембрана окружает раствор, содержащий уреазу.
Согласно другому методу, образцы предварительно обрабатывают уреазой и проводят измерение с помощью обычного аммиачного электрода 114]. Ионселективные электроды можно приспособить для измерения активности ферментов и концентраций соединений, служащих субстратами для некоторых ферментов 115~ Например, кристаллический мембранный Ндал/Нд1-электрод, предназначенный для прослеживания за иодид-ионом, можно использовать и для определения глюкозооксидазы и глюкозы, согласно уравнениям Глюкозооксикааа Глюкоза+НаО+Оа — 1- Глюкококая кислота + Н,Оа, мо Пч> Н Оа + 21 + 2Н+ — — ю ! я + 2НаО. Модифицированный проточный иодид-чувствительный электрод позволяет при наличии автоанализатора исследовать до 70 проб в час.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
