Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Эта ширина полосы указана для каждого прибора, и ее трудно определить в лабораторных условиях без узкополосного (=1 нм) интерференциониого фильтра. У монохрома- торов, у которых диспергирующим элементом служит решетка, 1пирина полосы достаточно постоянна в пределах данного диапазона длин волн, однако у призменных монохроматоров ширина полосы меняется с длиной волны.
В обоих случаях ширила полосы зависит от ширины щели. Точность измерения оптической плотности прп условии, что пет рассеянного света (см. ниже), зависит от отношения спектральной ширины полосы (характеристика прибора) к естественной ширине полосы, т. е. к ширине в панометрах на половипс высо- 169 ЧАСТЬ 1У. МЕТАБОЛИЗМ О уха УУО Угс ЛО ай О УУО УВР Лтна бсо ы, нм Рис.
16,1. 1 — график, показывающий естественную ширину полосы 1ЧАРН; естественная ширина полосы равна Вв нм. П вЂ” схематический график ширины полосы спектра выходящего излучения спектрофотометра; спектральная ширина полосы равна В нм. ты максимума поглощения образца (характеристика хромофора в растворе) (рис. 16.!,П). Так, с помощью недорогого спектрофотометра, имеющего при 340 нм спектральную ширину полосы 8 нм, можно измерить оптическую плотность образца с естественной шириной полосы 80 нм (величина отношения равна 0,1) с точностью 99,5о(з 1'41.
В случае хромофора с естественной шириной полосы 50 им при спектральной ширине 8 нм достигается точность измерения 99о1о. Восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (МАРН), соединение, наиболее часто анализируемое при 340 нм, имеет при этой длине волны естественную ширину полосы 58 нм. Отсюда ясно, что МАРН можно измерить с помощью недорогого спектрофотометра с более чем 99о1о-ной точностью (41 Влияние рассеянного света Еще одно следствие широкополосности илн низкой спектральной чистоты света — это повышение доли рассеянного света, т.
е. излучения, отличающегося по длине 170 !б. Фнзт!ческнгз метОды ь и ! !д лн'идя и'3м' 'и .тя (' мпммжз ,~~,жги зззмо зл Рис. 16.2. А. Оптическая плотность растворителей (слева направо: О,! М бромид натрия, зтиленхлоргидрии, дихлорзтан, ацетон), используемых для определения прнмеси рассеянного монохроматором света.
Б. Влияние различного процентного содержания рассеянного света на выполнимость закона Ламберта †Ва для хромофора. волны от указанного на шкале н выходящего за пределы спектральной ширины пропускання прибора. Поскольку спектральная ширина пропускання прнзменных монохроматоров зависит как от ширины щелей, так н от длины волны, от ннх зависит также н примесь рассеянного света. Рассеянный свет возникает нз-за неполного удаления нежелательных длин волн в результате несовершенства конструкции нлн загрязнения оптики. Примесь рассеянного света в выходящем световом пучке искажает линейную зависимость оптической плотности от концептрацнн хромофора, т. е. нарушает выполнимость закона Ламберта — Бэра.
Исследователь должен определять диапазон длин волн, в котором линейная зависимость сохраняется. Так как пРимесь рассеянного света возрастает прн уменьшении длины волны, простой н надежный способ определения рассеянного света в приборе заключается в использовании в качестве граничных светофильтров (пропусканне резко уменьшается в коротковолновой области) обычных растворителей 15~. На рнс.
16.2, А показана зависимость оптической плотности от длин волн для нескольких растворителей. Резкое отличие оптнче- 17! ЧАСТЬ ПА МЕТАГОЛИЗМ ской плотности, измеряемой обычными лабораторными спектрофотометрами, от ее номинальных значений указывает на то, что рассеянный свет преобладает над мопохроматнческпм. Поэтому невозможно измерять оптическую плотность растворов в области спектра, где примесь рассеянного света становится значительной. Влияние процентного содержания рассеянного света на выполнимость закона Ламберта — Бэра показано на рпс.
16.2,Б [41. Процентное содержание рассеянного света представляет собой пропускапие, выраженное в процентах, при длине волны, где граничный светофильтр непрозрачен. Новейшие широко используемые спектрофотометры позволяют производить точные измерения оптической плотности при ширине полосы 0,2 — 0,3 нм (2,0 — 3,0 й), но эта возможность может быть утрачена в результате загрязнения оптики, флуоресценции образцов или вследствие проникновения постороннего света. точность и линейность фотометричесних измерений В некоторых спектрофотометрах невозможно регулировать калибровку фотометрического блока, и линейность показаний лишь предполагается.
Поэтому, по крайней мере для одного спектрофотометра, нужно провести калибровку с помощью прилагаемых стандартов с известной величиной оптической плотности. В любом случае следует определить точность и линейность измерения оптической плотности и, если необходимо, составить таблицу погрешностей. В тех приборах, которые позволяют проводить калибровку шкалы оптической плотности, для ее настройки можно использовать набор нейтральных стандартных светофильтров с известными значениями оптической плотности при определенных длинах волн.
Если показания фотометра линейно зависят от оптической плотности светофильтров, то прибор считается откалиброванным. Национальное бюро стандартов н некоторые компании поставляют стандартные стеклянные светофильтры нли дают инструкции по приготовлению жидкостных стандартов оптической плотности [3, 71. 172 16.
Физический мйтоды нсшиша ч опта~и, ч плошпосшь а Опб н мо ьЕ ъ' ' О,НО со с1 а аи 'о ч с з ай)ОО О Об (О,' и Исшоннпв ойтс "псков плольас нь Наличие линейности прн определенной длине волны можно проверить с помощью одного из вариантов описанной ниже методики, используя либо стандарт с известной оптической плотностью, составляющей приблизительно 0,4 А (Ат), либо нейтральный светофильтр, либо раствор, имеющий примерно такую же оптическую плотность (Ан). Для этого нужно; 1) установить свето- о Е н В и ьс Рнс. 16.3. А. Зависимость из.
меренной (Аа) от истинной (Ат) оптической плотности длн спектрофотометра. Б. Зависимость ошибки определенна оптической плотности (ЛАа)ЛАт) от истинных значений оптической плотности. част! !т метАБОлизм фильтр в держателе таким образом, чтобы в пучок света можно было поместить либо образец сравнения (воздух нли воду), либо фильтр, и выставить пуль фотометра на образце сравнения; 2) поместить светофильтр на пути света и определить оптическую плотность (Ао,); 3) вновь поместить в пучок света образец сравнения (воздух или волу) и уменьшить щель так, чтобы образец сравнения дал какое-либо произвольное значение оптической плотности (Ах), например 0,1; 4) снова установить светофильтр и измерить оптическую плотность (Ао,).
11стинная оптическая плотность при таком измерении равна Ат (или Ан) +Лх. Наблюдаемая оптическая плотность равна Ло, + Ах. Этот процесс можно повторять несколько раз, уменьшая щель, когда в световом пучке находится образец сравнения, для получения величины оптической плотности Ат и определяя затем оптическую плотность светофильтра Ае , В результате получают ряд истинных и наблюдаемых значений Оптической плотности, постепенно возрастающих от Ат через определенные интервалы на шкале оптической плотности.
Прн более низком значении Ат число точек, необходимое для определения линейности, следует увеличить. На рис. 16.3, Л изображен график зависимости наблюдаемых значений оптической плотности от истинных для данного прибора. Если прирост значений на графике постоянен, то показания фотометра линейны. На рис.
16.3, Б показана зависимость ошибки (Ао — Лт)'! наблюдаемых значений оптической плотности (А,) от истинных значений поглощения. Этот график особенно наглядно показывает отклонение от линейности н величину ошибки. Влцяние !нирннь! щели Для призмеиных монохроматоров, работаюптих прн определенной выставленной щели, характерна сильно выраженная нелинейная зависимость спектральной ширины полосы от длины волны. В руководствах по эксплуатации спектрофотометров приводятся графики та'! Вместо (Ас — Ат) следует читать (аАц — ЛАТ).— Прим.
ред. 1?4 ш, оизическив мятоды кто кой зависимости; один из них для примера приведен па рис. 16.4. Таким обра- 6 зом, чтобы провести изме- Р с „ рения при постоянной спект- 7 ~ ральной ширине полосы с о.й помощью призменной опти- 3 ~ ки, необходимо установить ширину щели в соответствии с ~~, с графиком. Для точного определения концентрации е растворенного вещества еле- сй дует установить такую же ширину щели, как и при оп- ц~ ределении коэффициента по- лаз 4% бду глощения. С другой сторо- Длунн 60лмса ~~м ны, вместе с результатами рнс 164 Р нанна алннм натам определения коэффициента на спектральную ширину поло- поглощения необходимо ука.
см нрнамснного монохроматора зывать н спектральную нш рину полосы. При работе с призменными приборами приводят как ширину щели, так и график зависимости ширины полосы от длины волны для данного прибора. Аналогичным образом спектры следует регистрировать при постоянной ширине полосы, а не при постоянной ширине щели. Величины оптической плотности при определенной длине волны или спектры поглощения, полученные при двух различных значениях ширины щеля, редко бывают идентичными. Погрешность увеличивается при наличии острых максимумов н может быть незначительной в случае широких максимумов. Поэтому целесообразно использовать минимальную ширину щели. Кроме того, ширина щели зависит от чувсгвнтсльпостн фотометра, спектральных характеристик фотодетектора, а также от источника освещения. Еще более важно то, что на шцрину щели сильно влияют мощность лампы, чистота оптических поверхностей и качество фокусировки источника.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
