Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 30
Текст из файла (страница 30)
2. Добавляют 187,5 ед. акт. эндонуклеазы 81, чтобы запустить реакцию, и инкубируют 20 мнн при 50'С. 3. Останавливают реакцию, помещая пробирки со смесями в ледяную баню; в качестве соосадителя добавляют 50 мкг ДНК из тимуса теленка (в данном случае подходит любая имеющаяся в продаже не очень чистая ДНК) и 0,3 мл холодной 20%-ной ТХУ. Выпавший осадок собирают фильтрованием под вакуумом на мембранный фильтр (тнп НА, М!!Дроге Согр,). Фильтры вы- Таблица 15.3.
Определение гомологии между гетерологичиыми плазмидами при помощи видоиуклеазы, образующей разрывы в одной цепи ДНК Радиоактивность после обработки иуклеазой 51, импгмззн а Процент гомолагин, приаененный и с по- правкой Усредненный про- цент Процент в опыте Образец с фермен- том беа 4:ер- мента зН-Дг!К плазмиды, денатурированная нагреванием 100 Ж с. 0,3 6,0 820 881 5,5 7,! 6,3 45 63 7,0 7,0 7,0 860 880 60 62 а Значении радиоактивности были получены после вьыи.
б цифры в этой колонке получены путем вычитании цифтаннп фон» 20 имцзмнн. ры в строке 2 из соответствующих цифр в строках 3, а и б и последующим делениси на цифру в строне 3. Денатурированная нагреванием и реассоцннрованная плазмидная аН-ДНК Реассоциировавшая смесь денатурированных нагреванием плазмндной 'Н-ДНК н суммарной клеточной ЛНК, содержащей эту плазмидную ДНК Реассоциировавшая смесь денатурированных нагреванием плазмидной 'Н-ДНК и суммарной клеточ. ной ДНК, содержащей гетерологичную нлазмиду Реассоциировавшая смесь денатурированных нагреванием плазмидной Ч1-ДНК и суммарной клеточной ДНК из штамма, не содержащего плазмиды 20 18 50 53 790 798 821 832 850 890 850 825 2,4 2,2 6,0 6,0 92,9 96,7 ЧАСТЬ П! ГЕНЕТИКА сушивают при 70'С и определяют радиоактивность в сцинтилляционпом счетчике.
Контроли должны включать пробу с меченной 1п ч1чо плазмпдной ДНК, по которой можно выявлять любое количество присутствующей в препарате нуклеазы, производя!цей двухцепочсчные разрывы; пробу, содержащую только денатурированную и реассоциироваипую мечеи1ю ДНК, которая служит коитролем самореассоциации меченой ДНК в условиях опыта; пробу с денатурированной меченой ДНК, по которой судят об активности препарата эндопуклеазы Б1. В табл, 15.3 показано, как обработать исходные даииыс по радиоактивности, чтобы получить процент гомологии ДНК, Результаты выражены в виде процентов необработанных контролей по отиошепию к величинам, полученным для гомологичиой реакции.
15.3.5. Определеиие гомологии цепей ДНК с помощью электронной микроскопии Если двум частично комплементариым цепям плазмидной ДНК дать возможность ренатурировать, то образуются гетеродуплексные молекулы, которые можно исследовать с помощью электронного микроскопа. Поскольку при электронно-микроскопическом анализе в случае соответствующего приготовления образцов одно- и двухцепочечиые участки нуклеиновых кислот различаются, существует возможность картироваыия гомологпчных и иегомологпчных участков.
С тех пор как в практику вошли способы проверки с применением рестриктаз и методы выявления гомологий ДНК в растворе по радиоактивности, методология гетеродуплексного анализа с помощью электронного микроскопа перестала широко применяться для анализа плазмидной ДНК. Хотя техника такого анализа требует большого эксперимептального искусства и специального оборудования, она все же заслуживает рекомендации как способ точной локализации различий между плазмидами и наилучшей оценки организации плазмидной ДНК, По стандартной методике Кляйишмидта 1181 к ДНК прикрепляют основной белок, и оиа переходит в образованный денатурированными белками монослой, создаваемый на разделе фаз вода — воздух, Одноцепочечная 156 1Б плАзмиды ДНК сворачивается и на электронной микрофотографии имеет вид «куста». Однако в присутствии формамида однопепочечные участки более или менее расправляются, и в этих условиях их можно увидеть и отличить от двухцепочечных.
Таким образом, добавление формамида позволяет измерять одноцепочечные н двухцепочечные участки ДНК и служит основой для анализа формирования гетеродуплексов из цепей плазмядных ДНК. Методику Кляйншмидта с успехом применяют для определения молекулярных масс плазмидной ДНК путем измерения длины контура хорошо расправленных раскрытых, кольцевых или линейных, двухцепочечных молекул плазмидной ДНК. Если эксперименты по получению гетеродуплексов начинают с КЗК-ДНК, желательно ввести одноцепочечный разрыв таким образом, чтобы прп денатурации образовались две интактные молекулы — одноцепочечная линейная и одноцепочечная кольцевая.
Этого достигают следующим образом: сначала отделяют КЗК-молекулы от всех других и затем производят слабую обработку дезоксирпбонуклеазой или облучают видимым светом в присутствии бромистого этидия ~31. При такой слабой обработке образуются лишь одноцепочечные разрывы, КЗК-ДНК плазмид можно также расщеплять рестриктазами в условиях, когда расщепление происходит только по одному месту. Денатурацию обычно проводят прогреванием или обработкой щелочью. Способ, применяемый для денатурации ДНК, должен быть достаточно эффективным для того, чтобы привести к полному расхождению цепей, однако воздействие не должно быть настолько сильным, чтобы вызвать деградацию ДНК и внести дополнительные разрывы, Для ренатурации в водном растворе требуется высокая концентрация соли и нагревание до температуры примерно на 30'С ниже температуры плавления (Т,.). Однако н соль в высокой концентрации, н высокая температура могут привести к одноцепочечным разрывам.
Поэтому ренатурацию лучше осуществлять с формамидом — растворителем, эффективно снижающим Т . При этом пригодны достаточно разведенные растворы ДНК, а реакцию можно проводить при температуре, равной пли ниже комнатной, в течение более длительного времени. Оптимальна рена- 157 ЧАСТЬ и!. ГЕНЕТИКА Рис, 15.5. Образование гетеродуплекса между Й-плазмидой й6К и ее делецион.
ным мутантом к5Р!040 [7). Гетеродуплексные молекулы ДНК получали из ДНК двух плазмид, подвергавшихся одноцепочечному разрыву под действием рентгеновских лучей по методике, описанной в равд. 15.3.5. Петля слева представляет собой одноцепоче шую (за) ДНК плазмиды к6К, которая отсутствует из-за делеции в плазмиде !!5Р 1040. Большая петля справа — двухцепочечнан Дг!К (г(з), по которой можно рассчитать область гомологии обеих плазмид.
В данном случае двухцепочечная область составляет около 70% ДНК плазмиды !(6К. турация приблизительно бОогго взятой ДНК, так как продукты реиатурации смеси родственных молекул ДНК состоят из иереиатурировавших одиоцепочечиых фрагментов, гомодуплексов или гетеродуплексов. Поэтому кииетика реиатурации такова, что по достижении 50 — 75о(оного уровня реассоциации происходит предпочтительное образование гомодуплексов, а ие желаемых гетеродуплексов. На рис. 15.5 изображен типичный гетеродуплекс молекул плазмидиой ДНК, имеющих одиоцепочечиый разрыв, и ее делециоииой мутантной формы. Двухцепочечные и одиоцепочечиые области достаточно хорошо различаются. В основе любого электроиио-микроскопического анализа ДНК лежит приготовление моиомолекуляриого слоя иуклеииовой кислоты.
Для этого иа поверхности водного раствора создается пленка белка (цитохрома с). Денатурированный иа поверхности белок образует нерастворимую пленку, которую можно рассматривать как м. плхзмиды мономолекулярный слой. ДНК адсорбируется на белковой пленке и вследствие этого переходит из трехмерной конфигурации в растворе в двумерную на пленке.
Затем монослой с ДНК переносят в виде пленки на твердую подложку, покрывающую сетку для образцов, приготавливаемых для электронной микроскопии. Подложки обычно изготавливают нз парлодия или производных нитроцеллюлозы. Для улучшения контраста образец натеняют солями урана; применяется также натенение металлами, для того чтобы увеличить различие в контрастности между двухцепочечными и одноцепочечными участками ДНК. (Подробное описание методов электронной микроскопии см.
в гл. 4.) Следует избегать чрезмерного натенения, поскольку при этом из-за неровностей подложки и слишком толстого слоя металла, напыленного на участках, представляющих собой фон, разница в контрасте между фоном н объектом и между одноцепочечными и двухцепочечными ДНК уменьшится. В литературе описаны разные методики 118) приготовления белкового моно- слоя (например, методика растягивания, диффузионная методика, методика «высвобождения в один этап»). В случае методики растягивания кювету наполняют соответствующей гипофазой и на ее поверхность под углом (например, с предметного стекла) наносят раствор с белком и нуклеиновой кислотой. Для определения гомологии плазмидных ДНК при помощи электронной микроскопии рекомендуется следующий метод.
1. 0,1 мкг каждой нз двух ДНК, взятых для образования гетеродуплексов, помещают в маленькую пробирку типа Еррепдог1 (%ез( Соаз1 Яс(епИ1с Со., Р. О. Вох 2947, КосйгЫде 5(а(1оп, Оай(апб, СА 94618; номер по каталогу 3810). ДНК денатурируют добавлением 0,25 мл 0,1 М ИаОН, 0,02 М Ха,-ЭДТА я достаточного количества 1О М ХаОН (1 — 5 мкл) до установления рН в пределах 12,4 — 12,6.
Выдерживают ДНК в этом растворе при комнатной температуре в течение 1О мин. 2. Раствор нейтрализуют добавлением 25 мкл 1,8 М трис-НС1, 0,2 М трио-основания и 0,25 мл формамида (Ма!Нпскгог(1, 99%), Значение рН должно находиться между 8,4 и 8,6. Если это не так, то добавляют еще 159 ЧАСТЬ Н!.
ГЕНЕТИКА 2 мкл трис-буфера (при рН~8,6) или 2 мкл !ЧаОН (при рН(8,4). 3. Позволяют денатурированной плазмидной ДНК ренатурировать в течение 1,5 ч. Для прекращения ренатурацнп раствор охлаждают до 0 — 4'С и диализуют против 0,01 М трис-НС! и 0,001 М ЭДТА, рН 7 — 8,5, при 4'С 2 ч. Раствор, в котором прошла ренатурацпя, можно хранить при 4'С н отбирать из него пробы в любой момент в течение 1 мес, хотя ДНК в этом растворе продолжает ренатурировать даже при 4'С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
