Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Ргали. !(пс!е!с Ас!д йев., И, 39 — 100 (1974) . 32. Уоо!сИ Я. Р., С!огоев Я. С., Совдеп $. У., СигНвв Я., НС Оа?!а У., сайоге $. Вас!ег!о!. 1?еч., 40, 168 — 189 (!9?6). ЗЗ. Ого! Н. Сагпе8!е 1пв!. ЖавЫп5!оп Рпб!. 6!2, р. 97 — 106 (1956). 34. $ааги!а Кс !г., Сгавг(огИ !. Р. 3. Вас!ег!о!., 112, 797 — 805 (1972). 35. $Ытаг(а К„(Ре!вбеги й. А., боНевтап М.
Е. 3. Мо!. В!о!., 63, 483 †5 (!972). 36. Тотиев А. Аппп. Кеч. Сгепе!., 3, 217 †2 (1969). 37. )годе! Н. Х., Воппег 7?. М. Л. В!о1. СЬет., 218, 97 †1 (1956). 38. 57!!!еНв У. $. !п: 5. М!!впйав)в! (ед.), )! !ас!ог Игпи гев(в!васе р1авт!6, р.
89 — 107. 1!пгчегвйу о! То1суо Ргевв, То)суо (!977). 39. Х?аг)ег У. ??., ЕеИегЬег8 7. Л. Ввс!ег!о1., 64, 679 — 699 (1952). Глава 15 ПЛАЗМИДЫ Д'ж. Кроса, С. Фалкоу Термин «плазмиды» впервые был применен Ледербергом [211 для обозначения вссх внехромосомных наследственных детерминант. В настоящее время под этим термином понимают независимо реплицирующуюся внехромосомную ДНК бактерий. Хотя плазмиды не обязательны для жизнедеятельности бактерий в целом, они могут кодировать разнообразные генетические детерминанты, позволяющие бактериям-хозяевам лучше выживать в неблагоприятных условиях или успешнее конкурировать с другими микроорганизмами, занимающими ту же экологическую нишу.
Плазмиды имеются у множества бактерий ирассматривать вобщем плазмиды так же трудно, как рассматривать в общем несущие нх бактерии. В медицинском отношении важны, как известно, плазмиды, определяющие устойчивость к антибиотикам, — К-плазмиды, а также те из них, которые прямо оказывают влияние на патогенность микробов. Однако с позиций изучения структуры и функции ДНК все плазмиды представляют одинаковую ценность.
В последнее время плазмиды приобрели первостепенное значение в технике создания рекомбинантных молекул ДНК, Методы, которыми при помощи плазмид изучают перенос генов, были описаны в гл. 14. Данная же глава посвящена выделению и характеристике плазмид, в основном плазмнд грамотрицательных бактерий, так как они изучены лучше других, Тем не менее описываемые методы могут быть с успехом применены к плазмидам любой бактерии, если имеются подходящие способы их выделения из клеток в мягких условиях. Многие методы, применяемые в настоящее время для выделения плазмндной ДНК, основываются на ее суперспиральной ковалентно замкнутой кольцевой структуре.
Согласно всем этим методикам, необходим ливис 128 и. пллзмиды клеток в мягких условиях, так чтобы плазмидная ДНК сохранялась при этом в ннтактном состоянии и могла быть отделена физическими методами от более массивной хромосомной ДНК.
Хотя обычно плазмидная ДНК имеет мол, массу в пределах 0,5 — 100 1О', у некоторых больших плазмид она может составлять 100 — 300 10' [2, 12, 22, 24, 26, 27, 30]. Для сравнения напомним, что хромосомная ДНК Е. сой имеет мол. массу 2200 — 3000 106 Выявление свойств бактериальной плазмиды обычно начинают на генетическом уровне. Если есть подозрение на то, что какой-то бактериальный признак обусловлен плазмидой, в экспериментах по переносу генов часто можно показать передачу плазмидных детерминант независимо от хромосомных. Если же этот признак исчезает при обработке бактериальной популяции излечивающими агентами, такими, как акриднновый оранжевый или бромистый этидий, то можно быть почти уверенным в его плазмидном происхождении.
В большинстве случаев, однако, необходимо непосредственно убедиться в существовании плазмнды и в том, что именно она определяет изучаемый генетический признак. Если есть возможность, лучше всего перенести генетическими способами плазмиду какой-либо бактерии- хозяину, о которой известно, что она не имеет собственных плазмид. Для многих грамотрицательных бактерий этой цели лучше всего отвечает один из хорошо изученных Е -штаммов Е. сой К-12, такой, например, как С600.
Хорошо охарактеризованные бесплазмидные штаммы известны и для других видов (например, Рзеиг1отопаз аегийГпоза, К1еЬз1е11а рпеитопгае, Бегга11а тагсезсепз, опще11а ~1ехпеп', оа1топе11а!урИ и др,), Бесспорное преимущество такого подхода заключается в том, что после переноса отдельной плазмиды в подобный штамм при се последующем выделении нет боязни загрязнения плазмидами клетки-хозяина.
В тех случаях, когда генетические методы недоступны, приходится прямо проверять бактерию на содержание плазмид. Обычно таким анализом можно определить лишь, имеется плазмида или нет. Затем можно провести соответствующую проверку штамма, потерявшего генетический признак (спонтанно или в результа. 129 ЧАСТЬ И1 ГЕНЕТИКА те обработки химическими агентами), чтобы определить, теряется ли плазмида синхронно с определенной функцией клетки-хозяина. В клинической лаборатории или в лаборатории, где изучают рекомбинзнтные ДНК, часто бывает важно проанализировать большое число выделяемых штаммов на содержание плазмид. В клиническом аспекте набор плазмид в клетке может служить полезным эпидемиологическим маркером, а в научно-исследовательской лаборатории часто требуется идентифицировать различные классы рекомбинантной ДНК.
15.1. ВЫДЕЛЕНИЕ Г1ЛАЗМИДНОГ4 ДНК 15.1.1. Выделение с помощью тритона Х-100 (для Е. Сой К-12) Приводимый ниже метод 14, 19) хорошо подходиг для выделения плазмидной ДНК штаммов Е. сой К-12 в том случае, если клетки лизируют неионным детергентом тритоном Х-100 (Вескгпап !пз(гпгпеп(з, 1пс., РНПег1оп, СА, 92634). 1. Клетки выращивают при 37'С либо в богатой питательной среде (например, в сердечно-мозговом бульоне), либо в подходящей минимальной среде в условиях слабой аэрации, достигаемой покачиванием колбы на скорости, которой едва хватает, чтобы црнвести в движение поверхность среды. Культуру объемом 100 мл помещают в 250-мл колбу Эрленмейера; эти величины могут быть пропорционально уменьшены или увеличены, Для получения оптимального ливиса клетки следует собирать в середине логарифмической фазы роста.
2. Суспензию с клетками центрифугируют в 250-мл стаканах (например, в течение 10 мин при 12100 н при 5'С) в роторе 6$-А центрифуги 5огта11, ресуспендируют осадок в 15 мл буфера ТЭН (0,05 трис, 0,005 М ЭДТА, 0,05 М МаС1, рН 8,0), переносят в 40-мл стакан и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин при 5'С в роторе 35-34 центрифуги 3огча11. Осадок рссуспендируют в 1 мл охлажденного во льду 25з~з-ного раствора сахаровы (в 0,05 М трисе, 0,001 М ЭДТА, рН 8,0) и оставляют стакан во льду на 30 мин. 1ЗО 16 пллзмиды 3. Добавляют лизоцим (0,2 мл раствора с концентрацией 5 мг!мл в 0,25 М трисе, рН 8,0). Несколько раз круговыми движениями руки перемешивают содержимое центрифужиого стакана и вновь оставляют его во льду иа 10 мин.
4. Добавляют 0,4 мл 0,25 М ЭДТЛ, рН 8,0. Перемешивают содержимое и оставляют стакан во льду еще на !О мип. 5. Добавляют 1,6 мл лизирующсй смеси с тритоном Х-100 (1 мл 10~/а-ного тритоиа Х-100 в 0,01 М трисе, рН 8,0, плюс 25 мл 0,25 М ЭДТА, рН 8,0, плюс 5 мл 1 М триса, рН 8,0, плюс 69 мл воды). После о«епь осторожного, но тщательиого перемешиваиия суспензии круговым движением стакан оставляют во льду на 20 мии.
6, 1Хситрифугируют содержимое прп 35000 д в течеиие 20 мин при 5'С на центрифуге 5огча!! или Вескшап 321 (в роторе 55-34 или ЛА-20 соответственно). Этим методом от основной массы хромосомной ДНК и клеточных обломков отделяется около 95а(а плазмид. Обогащенную плазмидами надосадочиую фракцию (3,2 мл) подвергают дальнейшей очистке и концентрированию центрифугироваиием в градиенте плотности хлористого пезия в присутствии бромистого этидия (цезий-этидиевый градиент; разд.
15.3.3). 15.1.2. Выделение с помощью тритона Х-100 (для других грамотрицательных бактерий) Квакенбуш (личное сообщение) несколько модифицировал изложенный в предыдущем разделе метод, благодаря чему была улучшена четкость полос в агарозиом геле при электрофорезе (равд. 15.3,1). Его модификация относится к лизатам иекоторгях бактерий, например Рзеиг(отопаз аегиа!поза, 5ггга(!а тагсеасепз, Рго!енз ге!дег! и К!ебзге!!а рпеитоп(ае. 1. Выращивают 40 мл культуры в 100-мл колбах со встряхиванием в сердечно-мозговом бульоне (О!1со (.аЬога1олез, г. Детройт, шт. Мичиган).
2. Клетки собирают цситрифугировапием в течение 10 мин при 5000 об/мии (в роторе 55-34 иа центрифуге Вогча!1) . 131 ЧАСТЬ !!1 ГЕНЕТИКА 3. Клеточный осадок суспендируют в 5 мл буфера ТЭН (равд. 15.3.1). 4. Суспензню центрифугируют так же, как н ранее. 5. Осадок суспендируют в 2 мл 25!Уз-ного раствора сахарозы (в 0,001 М ЭДТА, 0,05 М трнсе, рН 8,0). Центрифужный стакан оставляют во льду на 20 мнн.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
