Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 23
Текст из файла (страница 23)
14.2.1). Следует, однако, иметь в виду, что такая операция очень трудоемкая; иногда достаточно точные результаты дает метод отпечатков. В последнем случае в чашки с агаром ЕМВО вносят 50 †1 мкл фаголизатов Т5 и Тб (с концентрацией 10" ПОЕ/мл). Для каждого фага прн перепечатывании с исходной чашки берут свой кусок бархата, так как перенос фага из одной чашки в другую может исказить результаты. Несмотря на то что мутация 1опА обусловливает также 1!6 14.
ПЕРЕНОС ГЕНОВ устойчивость к фагу Т1, при обращении с этим фагом следует соблюдать особую осторожность и твердо придерживаться правил асептики. Фаг Т1 устойчив к высушиванию н обладает очень коротким латентным периодом. Именно из-за него пе одна лаборатория вынуждена была свернуть исследования с применением Е. со1Ь После того как установлен фенотип всех трансконьюгантов типа Тгр+1ча1', можно подсчитать число рекомбинантов каждого класса и, исходя из него, получить расстояния между маркерами на генетической карте и их последовательность в Н1г-хромосоме.
Применение Используя разнообразные родительские формы Н1г в отношении начала и направления хромосомного переноса при изучении конъюгации с помощью метода пересекающихся штрихов на агаре, для мутантного аллеля, выявляемого в реципиенте Р, легко установить ориентировочное расположение аллеля дикого типа [4!. В целях более точной его локализации по отношению к другим генам можно использовать прерываемую конъюгацию с соответствующим штаммом Н1г.
Однако, чтобы точно указать расположение этого локуса по отношению к локусам, находящимся в непосредственной близости от него, может оказаться необходимой обшая трансдукцня, опосредованная фагом Р1, так как кон ьюгация часто не вполне подходит для этой цели. 14.4. СРЕДЫ И ШТАММЫ Как правило, в работе по переносу генов используют самые обычные, имеюшиеся в продаже среды, Ниже описаны только те из них, которые требуют модификации или дополнительных добавок.
Приводятся также источники штаммов бактерий и фагов. 14.4.1. Ь-Бульон и Ь-агар [24! Для приготовления Ь-бульона на 1 л воды берут 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г ХаС1 и 1 г глюкозы. рН раствора доводят до 7,0 добавлением перед 117 ЧАСТЬ 111. ГЕНЕТИКА автоклавированием приблизительно 1,7 мл 1 н. 5!аОН. 1-агар — это Ь-бульон, содержащий 1,5% агара.
Для получения сплошного лизнса в чашках с использованием бактериофага Р1 берут 1,2% агара. Мягкий 1.-агар содержит 0,65% сухого агара. Для экспериментов с такими фагами, как Р1, к Ь-средам добавля1от СаС1, до конечной концентрации 2,5 мМ, причем это делают после автоклавировання и охлаждения среды по крайней мере до 70'С. Среды с СаС!1 не подлежат повторному автоклавированию, поскольку при автоклавировании в них может образоваться осадок. Обычно для работы готовят стерильный водный раствор 1 М СаС!м 14.4.2.
Агар лямбда Для прикрепления и проникновения в бактериальную клетку бактериофага Х на поверхности клетки должны присутствовать белки переноса мальтозы, синтез которых тормозится глюкозой по механизму катаболитной репрессии. Поэтому агар лямбда не должен содержать глюкозу. При его приготовлении на 1 л воды добавляют 1О г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г ХаС! и 12 г агара. рН доводят до 7,0 перед автоклавированием добавлением 1,7 мл 1 н.
КаОН. Мягкий агар лямбда содержит 0,65% агара и 10 мМ Мн'4. 14.4.3. Супер-бульон 1261 Приготовление 74-фаголизатов и лизатов многих других фагов лучше всего удается, когда для выращивания клеток-хозяев используют богатую питательную среду. Одна из таких сред — супер-бульон — содержит в 1 л 32 г триптона, 20 г дрожжевого экстракта и 5 г ХаС!. рН доводят до 7,0 перед автоклавированием добавлением приблизительно 5 мл 1 н. !чаОН. Для лучшего размножения фага к бульону после автоклавирования добавляют Мд504 до 10 мМ. Обычно для работы готовят водный раствор 1 М Мп504. 14.4.4. Агар Репаззау Имеющийся в продаже агар Репаззау вполне удовлетворителен в качестве общей комплексной агаровой среды, но добавление 1!аС! (8 г/л) значительно расширяет 118 44.
ПЕЕЕНОС ГЕНОВ область его использования во многих экспериментах по бактериальной генетике. Имеющийся в продаже бульон Репазвау уже содержит моновалентные катионы. 14.4.5. ЕМВ-агар и агар Мак-Конки Изготавливаемые в промышленных масштабах агары ЕМВ и Мак-Конки являются удовлетворительными индикаторными в отношении брожения средами при работе с грамотрицательиыми кишечными бактериями. Однако, поскольку многие штаммы Е. со!1, Би!топе!!а, а также другие штаммы, используемые в экспериментах по переносу генов, имеют мутации, которые делают их ауксотрофами по отношению к пуринам, пиримидинам и (или) витаминам, следует на каждый литр среды добавлять 5 г дрожжевого экстракта. Желательно также добавление КаС! в количестве 5 г/л в среды, используемые для проверки чувствительности штаммов бактерий к фагу. Агары ЕМВ и Мак-Конки обычно дополняются сахарами до конечной концентрации 14/4 и обозначаются ЕМВ+Оа!, Мас+1.ас и т.
д. ЕМВ-агар, не содержащий сахаров, используется для проверки чувствительности бактерий к фагам и обозначается как ЕМВО-агар. В табл. 14.3 перечислены концентрации стерильных исходных растворов наиболее часто используемых сахаров. 14.4.6. Минимальная среда 4!В-Е !371 Для приготовления 50-кратного исходного раствора в 670 мл дистиллированной или деионизованной воды последовательно растворяют 10 г Мд504 7Н,О, 100 г лимонной кислоты, содержащей один остаток воды, 500 г безводного КгНР04 и 175 г ЫаХН4РО4 4Н40. Окончательный объем раствора 1 л.
Чтобы приготовить однократную жидкую минимальную среду Ъ'В-Е, приливают 20 мл стерильного 50-кратного раствора к приблизительно 960 мл стерильной дистиллированной илн деионизованной воды с таким расчетом, чтобы при внесении стерильного раствора углеводов и других требуемых добавок (см. ниже) конечный объем равнялся бы 1 л.
Для приготовления однократной минимальной ага- !!9 ЧАСТЬ !(!. ГЕИЕТИКА ровой среды УВ-Е к 960 мл дистиллированной или деионизованной воды добавляют 15 г агара и автоклавируют; после остывания до 60 — 70'С добавляют 20 мл стерильного 50-кратного раствора и соответствующее количество углеводных и других добавок. Прн использовании в качестве индикатора брожения триметилтетразолийхлорида его добавляют к агару перед автоклавированием. Однократные минимальные жидкая (М1) и агаровая (МА) среды имеют рН 7. 14.4.7.
Солевой буфер с желатиной (СБЖ( [1О]) 14.4.8. Добавки Углеводные источники энергии для бактерий (табл. 14.3) обычно добавляют к минимальным средам до конечной концентрации 0,5о(о. Таблица 14.3. Концентрации стерильных исходных растворов источников углерода" Концентрация основно го раствора, еу Концентрация основного раствора. Исгочникп углерода Исгочннки углерода ььйрабнноза 0-Галактоза (л-Глюкоза В-Глицерине Лактоза 20 30 40 40 20 30 10 20 Мальтоза (х-Маннитол Яитарнокислый натрий Г(-Ксилоза 30 п Все концентрации приведены в единицах веса на объем Подогрев дк.
стиллнрованной (или деиоииэованнок! воды способствует растворению углеводов, но перед доведением до точного объема эюгм растворам дают остыть до комнатной температуры. Поред испольэованнем все растворы стерилиэуют автоклавированием (для объемов, не превышающих 250 мл в течение 20 мип! п эатем хранит при ('С. б посиольку глицерин — жидкость, для полученпя его (бур-гюго (вес(объеьо раствора добавлягот З(,У мл исходного раствора к ВВ,З мл воды.
СБЖ относится к растворам, используемым для разведения. Присутствующая в нем желатина стабилизирует фаговые частицы и хрупкие бактсриальные клетки, а также улучшает точность разведений. Для приготовления СБЖ смешивают 8,5 г ()аС!, 0,3 г безводного КН2РО(, 0,6 г безводного )к)азНРОа, 1О мл ! %-ной же. латины и 990 мл воды. Ы. ПЕРЕНОС ГЕНОВ Казаминовые кислоты или другие кислотные гидро- лизаты казеина, как правило, добавляют к минимальным средам до конечной концентрации 0,5Р/о.
10%-ные (вес/объем) исходные стерильные растворы хранят при 4'С. Добавка аминокислот к минимальным средам стимулирует рост бактерий и особенно полезна при проведении генетических экспериментов с мутантамн, требующими присутствия триптофана (который разрушается при кислотном гидролизе белков), пуринов, пиримидипов и витаминов.
В последнем случае используют смесь аминокислот без примеси витаминов. Оптимальные концентрации добавляемых в минимальные среды аминокислот, пуринов, пиримидинов и витаминов, при которых становится возможным рост клеток с ауксотрофными мутациями, часто приходится определять эмпирически. Среди факторов, имеющих важное значение при подборе концентраций добавляемых веществ, укажем следующие: количество добавляемого соединения в биомассе клеток, эффективность проникновения этого соединения в клетку, использование его для синтеза клеточных компонентов, способность бактерий расщеплять добавляемое вещество. В табл.
14.4 приведены концентрации аминокислот, пуринов, пиримидинов и витаминов в стерильных исходных концентрированных растворах и конечные концентрации этих веществ при добавлении к минимальным средам, позволяющие обеспечить максимальный рост мутантпых штаммов Е.
сой и других грамотрицательных бактерий. В экспериментах, связанных с переносом генов, часто используются штаммы бактерий, обладающие устойчивостью к антибиотикам либо за счет хромосомных мутаций, либо за счет присутствия К-плазмид (гл. 15). В табл. 14.5 включены концентрации антибиотиков в ис. ходных концентрированных растворах и концентрации антибиотиков, обычно используемые в опытах по переносу генов, в средах для грамотрицательных кишечных бактерий.
Следует отметить, что в стерилизации исходных концентрированных растворов антибиотиков нет необходимости, если были соблюдены соответствующие меры предосторожности во время их приготовления. При этом используют бумагу для взвешивания из закрытой коробки нли запечатанного контейнера (бумага, нахо- 121 ЧАСТЬ 111. ГКНЕТИКА Таблица 14.4.
Концентрации аминокислот, пурннов, пнрнмидннов н витаминов для основных растворов н длн добавок к минимальным средам Количество основного раетвора, добавяяемогоиа1л мяивмаяьиоа среды, мя Кояечвая коидситрацяя в мивимаяьвых средах, мкг/ма Кояцеитрация осяовного раствора, мг/мя Соедияеввя Аминокислоты' кислота кислота Пррины и лиримидины Аденин Тимидин Тимин Урацил 2,0а 10,0 5,0 2,0 20,0 0,4 илн 4,0 0,4 или 8,0 20,0 40 4 нли 40" 2 или 40" 40 122 01.-Алании' Ь-Аргинин НС! Ь-Аспарагин Ь-Аспарагинован ЬтЦистеин НС!с Глицин Ь-Глутаминозая 1.-Глутамин 1.-Гнстнднн. НС! Ь-Изолейцин 1.-Лейцин Ь-Лизни НС1 0ЬтМетионин Ь-Фенилаланин Ь-Пролив 0Ь-Серии 01.-Треонин Ь-Триптофан Ь-Тнрозин 0ЬтВзлин 50,0 11,0 10,0 10,0 11,0 50,0 10,0 20,0 11,0 10,0 10,0 44,0 10,0 1О,Ос 15,0 !0,0 40,0 4,0 2, Овг 20,0 2,0 2,0 10,0 10,0 2,0 2,0 10,0 5,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 10,0 2,0 5,0 10,0 2,0 100 22 100 100 22 100 100 100 22 20 20 88 20 20 30 100 80 20 20 40 !4, ПЕРЕНОС ГЕНОВ Продолжение табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
