Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 20
Текст из файла (страница 20)
За исключением редких случаев достаточно длительной конъюгации, когда возможен перенос всей Н1г-хромосомы, болыпинство трансконъюгаитов, унаследовавших хромосомный материал Н1г, сохраняет генотип Р-, так как части интегрированной Р-плазмиды передаются последними в качестве замыкающих маркеров. Скорость передачи Н1г-хромосомы постоянна при 37'С. Используя клетки штамма Г в большой концентрации и прерывая конъюгацию на последовательных этапах, можно определить время, необходимое для переноса любого маркера, и интервал времени, проходящий между переносом последовательно передающихся маркеров. Проводя опыты по конъюгации с Н1г-клетками при 37'С, удалось определить, что перенос всей хромосомы Е.
сой занимает 100 мин; прн этом скорость передачи ДНК составляет 26 10' дал/мин. Р-Плазмнда в данном случае, подобно другим конъюгативным плазмидам, содержит так называемые 13-последовательности (от англ. !пзегБоп зе!)цепсез), которые присутствуют и в хромосоме Е. со/1. Именно взаимное узнавание этих последовательностей с последующей рекомбинацией позволяет фактору Г определенным образом встраиваться в хромосому Е.
со1! "17~1. Генетическими методами было идентифицировано около 25 — 30 мест интеграции фактора Г, что привело к созданию Н1г-доноров с разным началом и направлением переноса хромосомы [13, 27). Более полное обсуждение процесса и механизма 102 и. пеганос ганов конъюгации можно найти в различных обзорах 13, 11, 12, 381, а также в учебниках и монографиях 116, 18, 21, 25]. С методами осуществления конъюгационных скрещиваний, помимо приведенных ниже, можно ознакомиться в руководствах Клоуса и Хэйеса [11 и Миллера 121.
Общие методы Поскольку цель экспериментов по конъюгации заключается в выделении трансконъюгантов, обладающих признаками как донора, так и реципиента, следует использовать штаммы с генетическими маркерами, легко поддающимися отбору. В экспериментах по изучению кинетики конъюгационного переноса важно уметь останавливать процесс конъюгации через точные интервалы времени и предотвращать дальнейшее его течение на селективной среде; эта проблема возникает при высеве клеток донора и реципиента с высокой плотностью. Простейший способ достичь этой цели — использовать реципиентный штамм, устойчивый к налидиксовой кислоте благодаря мутации в гене па1А. Налидиксовая кислота ингибирует конъюгационный перенос ДНК, и при ее добавлении к смеси конъюгирующих бактерий, состоящей из чувствительного к этой кислоте донора и устойчивого реципиента, перенос как плазмидной, так и хромосомной ДНК немедленно останавливается.
Для этого же были использованы реципиентные клетки, устойчивые к рифампицину вследствие мутации в гене гроВ, но рифампицин не вызывает мгновенной остановки конъюгационного переноса ДНК. Он останавливает транскрипцию генетической информации донора, что крайне полезно прн попытке выявить происходящий с низкой частотой перенос плазмиды, определяющей устойчивость к лекарственным препаратам, таким, как ампнциллин, так как продолжающийся в доноре синтез 8-лактамазы приводит к инактивации включенного в среду ампициллина и препятствует выявлению трансконъюгантов типа Ар'.
Большинство конъюгативных плазмид природных штаммов бактерий репрессированы в отношении экспрессии донорного фенотипа, так что лишь одна из 1000 — 10000 клеток, имеющих такую плазмиду, способна в оптимальных условиях передавать ее. Но, поскольку 103 ЧАСТЬ ПЬ ГЕНЕ1'ИКА при передаче в реципиентную клетку в некоторых случа.
ях происходит временная дерепрессия, для выявления переноса конъюгативной плазмиды иногда требуется проводить спаривание в течение нескольких часов или больше и периодически делать разведения смеси коньюгирующих бактерий для поддержания соответствующих плотностей. Выделены мутанты, у которых конъюгативные плазмиды дсрепрессированы; генетическими допорами практически могут быть все донорные клетки таких мутантов, содержащих конъюгативную плазмиду. Г-Плазмида — одна из наиболее охарактеризованных дерепрессированных конъюгатнвных плазмнд. Хотя некоторые плазмиды стимулируют конъюгационный перенос ДНК в условиях контакта клеток в жидкой среде, другие более эффективны в этом отношении при спаривании клеток донора и реципиента на агаре нли на мембранном фильтре, лежащем на питательной агаровой среде, В последнем случае на питательный агар обычно наслаивают питательный мягкий агар и чашки ннкубируют в неперевернутом виде нужный период времени, после чего фильтр перекладывают на чашку с селективным агаром, на котором не способны расти клетки-доноры.
Можно поступить иначе: погрузить фильтр в солевой буфер и удалить с него клетки периодическим встряхиванием в смесителе типа Ъог$ех, после чего засеять соответствующие разнедения на селективную агаровую среду. Другая варьируемая величина, за которой необходимо следить при определении оптимальных условий коньюгационного переноса, — это температура. Многие коньюгатнвные плазмиды энтеробактерий переносятся с наибольшей частотой, когда спаривание проводят при температуре 37'С или близкой к ней. Для некоторых из ннх перенос идет при 25'С, но его трудно выявить, и, если оставить культуры донора перед смешиванием с клетками реципиента на некоторое время при комнатной температуре, это может привести к значительному снижению частоты переноса, происходящего при 37'С. Вместе с тем существуют конъюгативные плазмнды, например в группе 1псН, для переноса которых оптимальна температура 25'С, и онн хуже переносятся при 37'С.
Анализируя возможность передачи признака конъюга- 104 !Е ПЕРЕНОС ГЕНОВ тивной плазмидой, целесообразно сопоставить течение процесса при 37 и 25'С. Рестрикция — это процесс деградации чужеродной ДНК в том случае, когда микроорганизм распознает поступающую в него ДНК как отличную от своей.
Иногда рестрикцией объясняется невозможность обнаружения переноса конъюгативных плазмид при внутривидовых, межвидовых и межродовых скрещиваниях. Мутанты, лишенные систем рестрикции (йзпЯ или ЬИ5), имеются у Е. соП К-12, 5. 1урИтигшт 1.Т2 и других хорошо охарактеризованных и часто используемых видов бактерий. Даже в отсутствие реципиента, неспособного осуществлять рестрикцию, зта потенциально существующая проблема часто может быть решена прогреванием клеток реципиента перед конъюгацией в течение 5 — 10 мин при 50 'С илн 15 — 20 мин при 45'С. Действительно, я наблюдал, что при выращивании в течение 5 — 7 генераций перед коныогацией при 42'С многих реципиентных штаммов Е, сой более 95% из них становились способными к восприятию конъюгативных плазмид.
14.3.1. Перенос коиъюгативных плазмид (Р'- или К-плазмид в Е. сой Р-) Бакгериальные штшимы Изучение переноса конъюгативных плазмид облегчается, если плазмида определяет признак, по которому легко вести отбор. Р'-Плазмиды (имеющиеся у Н1г-доноров) несут помимо фактора Р последовательности хромосомной ДНК, которые примыкали к фактору Г, когда он был интегрирован в хромосому. Например, донорные клетки штамма 9 (табл. 14.1), имеющие плазмиду Р'1ас+, могут легко передавать признак 1ас клеткам штамма Р-, например штамма 10 (табл.
14.1), причем образующиеся трансконъюганты легко отобрать. Нет трудностей и при изучении переноса П-плазмид. Легко выявляется перенос дерепрессированных производных П-плазмид, таких, как плазмнда 0100 г(гс(-1 штамма 11 (табл. 14.1), поскольку эта плазмида обусловливает устойчивость к тетрациклину (Тс") в концентрации 25 — 50 мкг/мл, хлорамфениколу (Сш") в концент- 1Рз ЧАСТЬ 1П, ГЕНЕТИКА рации 50 мкг/мл, стрептомицину (5гп') в концентрации 50 мкг/мл и сульфаниламиду (5п') в концентрации 25— 40 мкг/мл (на синтетической среде). Донор, имеющий плазмиду )х100 бгб-1, должен быть чувствительным к налидиксовой кислоте, а реципиент, такой, как штамм 10 (табл.
14.1), не должен обладать устойчивостью ни к одному из антибиотиков, устойчивость к которым придает )х100 бгб-1, и должен иметь мутацию па(А. Среды Оптимальный рост и максимальную экспрессию фенотипов донора и реципиента обеспечивают н 1.-бульон, и бульон Репаззау. Для титрования культур донора и реципиента можно использовать агар Репаззау (с 8 г )чаС! в 1 л).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
