Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Например, 2 мин прн 37'С нли 1 мин при 42'С могут оказаться более эффективными, чем 2,5 мин при 30'С. 11. Вслед за тепловым шоком смесь нейтрализуют до рН 7,0 добавлением 3 мкл 2 М триса, рН 7,4. !2. Если донорный маркер, по которому ведется отбор, обусловливает устойчивость к антибиотику (в особенности бактерицидному), смесь разводят 1:1О ростовой средой и ивкубнруют при 37'С в течение 60 — 90 мин для экспрессии маркера устойчивости. 13.
Высевают смесь (разведенную или неразведенную в зависимости от типа взятой ДНК, а также от того, разводили се илн нет для выявления экспрессии) на среду, позволяющую отобрать трансформированные клетки, и в соответствующем разведении на несслектпвную среду для определения выживаемости. Так как обработка клеток СЕС14 делает их непрочными, следует использовать свежеприготовленную, ие сильно подсохшую среду, Важно также не допускать высыхания засевасмого материала: после распределения разведенной суспензии по поверхности агара дают ей впитаться в агар, приоткрыв слегка крышку чашки Петри на несколько минут. 14. Чашки ннкубируют 1 — 2 сут прн 37'С в соответствующем режиме, зависящем от маркера, по которому ведется отбор, и от скорости роста реципнентного штамма.
ЧАСТЬ П! ГЕНЕТИКА Применение Трансформация — важный метод генетического анализа, так как имеющиеся в природе способные к трансформации виды ие имеют систем конъюгации, и только небольшое число видов имеет хорошо развитые системы трансдукции. В аспекте фундаментальной науки трансформация позволила составить представление о механизме генетической рекомбинации [25, 31], а в случае Вас!11из зиб1Г)ГЕ ее изучение способствовало получению информации о начале и направлении репликации хромосомы 118]. Данные зкспсриментов по внутривидовой и межвидовой трансформации использовались также для определения степени генетического родства между определенными участками генома 131]. Такой подход стимулировал изучение родства с использованием анализа кинетики реассоциации ДНК (гл.
22) и новейших методических приемов при исследовании рекомбииантной ДНК, Использование трансформации и трансдукции тесно связано с методологией изучения рекомбинантной ДНК, где благодаря искусственной индукции компетентности возможно введение рекомбинаитиых молекул в клетки различных видов бактерий.
14,2. ТРАНСДУКЦИЯ Бактернальные вирусы делят на вирулентныс, прн инфицировании которыми все зараженные клетки гибнут с высвобождением новых фаговых частиц, и умеренные, вызывающие либо ливис инфицированных бактерий с высвобождением потомства новых фагов, либо их лизогенизацию 14]. В лизогенном состоянии фаговый геном, называемый уже профагом, реплицнруется синхронно с бактериальной хромосомой в форме плазмиды илн включаясь в хромосому. Несмотря на то что вирулентные !раги и вирулентные мутанты умеренных фатов способны к трансдукции, в природе основной приток генов в бактерии за счет траисдукцни обусловлен лизогенными умеренными фагами, которые представляют собой наиболее простые системы для изучения.
Известны два типа трансдукции — специфическая и общая 118]. В случае специфической Грансдукции могут ПС ПЕРЕНОС ГЕНОВ передаваться лишь генетические маркеры донора, прилежащие к интегрированному профагу. Под общей трансдукцией понимают передачу любого признака донора независимо от того, расположены ли его детерминанты в хромосоме, плазмиде или профаге. В соответствии с этим специфическая трансдукция наблюдается только в том случае, когда фаговый лизат получают путем спонтанного или индуцированного высвобождения фага из лизогенного донора, и никогда — в случае размножения фага в ходе литического продуктивного цикла.
Вместе с тем в случае фатов, способных к общей трансдукции, генетическая информация донора может извлекаться как после индукции культуры лизогенного донора, так и в результате литического продуктивного цикла. Фаги, осуществляющие специфическую трансдукцию, содержат участки генетического материала донора, замсстившие участки фагового генома. Таким образом, эти фаги представляют собой рекомбинанты, содержащие как собственную, так и генетическую информацию клетки-донора. При инфекции и лизогеннзации определенного рецнпиентного штамма фатами, способными к специфической трансдукции, клетки этого штамма находятся в состоянии частичной диплоидии, когда имеется и генетическая информация донора, содержащаяся в трансдуцирующем фаге, и гомологичная генетическая информация в хромосоме реципиента.
Если генетическая информация донора заменяет в фаге, осуществляющем специфическую трансдукцию, генетическую информацию, жизненно необходимую для размножения фага, трансдуцирующий фаг становится дефектным и неспособным к размножению и развитию в отсутствие интактного генома фага-помощника. В некоторых случаях, однако, фаг, способный к специфической трансдукции, не теряет главных функций, он может нормально осуществлять продуктивный литический цикл и образовывать стерильные пятна.
В наиболее изученных системах образование фагов, участвующих в общей трансдукции, сопровождается случайной упаковкой донорного генетического материала вместо фагового. Поэтому фаговые частицы, способные трансдуцировать ДНК донора, полностью дефектны.
Реципиентная клетка, инфицированная такой частицей, в Щ ЧАСТЬ !Н ГЕНЕТИКА отсутствие одновременной множественной инфекции нормальнымн фаговыми частицами приобретает только генетический материал донора, но не фага. Проникнув в реципиентную клетку, генетическая информация донора (если она хромосомного происхождения) интегрирует и заменяет генетическую информацию реципиента илн существует отдельно без интеграции и репликации; образуются так называемые абортивные трансдуктанты. Фаги, осуществляющие общую трансдукцию, способны также включать в себя и траисдуцировать генетическую информацию плазмид.
Последние могут приживаться в клетке-реципиенте и начинают реплицнроваться синхронно с хромосомой реципиента. Прн изучении трансдукции необходимо, чтобы донор и реципиент различались в отношении соответствующих легко распознаваемых генетических призяаков. Обычно реципиент несет мутации, делающие его неспособным синтезировать какой-нибудь метаболит или использовать какой-нибудь источник углерода. Реципиент может также обладать признаком дикого типа, обусловливающим чувствительность к какому-либо антибиотику, препарату или фагу. Клетка-донор должна иметь противоположный аллель, по которому легче всего вести отбор в случае наследования этого признака трансдуктантамн.
Общие методы Чтобы получить специфически трансдуцирующие лизаты, нужен штамм донора, лизогенного по отношению к трансдуцирующему фагу. В зависимости от конкретной системы лизат можно приготовить индукцисй штамма-лизогена ультрафиолетом или митомицнном С; еще лучше, если у этого штамма имеется профаг, индуцируемый тепловой обработкой, для которого лизогения стабильно поддерживается при 30 'С, а литическая реакция индуцируется обработкой при температуре 37 'С ~!9~. Чтобы получить лизаты для общей трансдукции, инфицированные бактерии-доноры обычно выращива!от в жидкой среде или высевают в чашки методом наслоения мягкого агара, где наблюдается сплошной лизис ~2~. Для обеспечения максимального выхода фага и в том и 82 14, ПЕРЕНОС ГЕНОВ в другом случае выращивать и инфицировать бактерии нужно в среде с соответствующими концентрациями катионов.
В большинстве случаев лизаты трансдуцирующих фагов хранят над хлороформом, который убивает все неинфицированные и неиндуцированные клетки донора. Условия, обеспечивающие оптимальное инфицирование реципиентного штамма, зависят от используемой системы фаг — хозяин; особое внимание при этом уделяется содержанию ионов в среде и способам выращивания реципиента. В большинстве систем перед посевом с целью отбора трансдуктантов проводят предварительную адсорбцию фага на реципиентных клетках. Поскольку большинство фагов в трансдуцирующем лизате обладает инфекционностью и способно убить реципиентные клетки, применяются методы, позволяющие избегать инфекции н гибели траисдуцированных клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
