Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 12
Текст из файла (страница 12)
К., тало(зйч С. А ЫосЬстйа! апд депепс Миду о1 гечегвюп Мй йе А-депе А-рго1е!п яуиеп! о1 ЕзсйегкМа сод 1гур1орйап ьупйе1аве. Оепепсв, 48, 1065 — 1083 (1963). 7. Атея В. У. Рдеп1Иу!пд епч!гоптеп1а! сйегшса!в сапипд тп!апопв апд сапсег. Бс!епсе, 204, 587 — 593 (! 979). 8. Атея В. У., МсСалл У., Уатазайи Е. Мейодь 1ог де1есппд саге(- подепз апд пш(адель тч(й йе Ба1топе11а/тапппаиап-ппсгояогпе тп1адеп!с!!у 1езй Мп1а(.
Яеь., 31, 347 — 364 (1975). 9. Саг1!ол В. С, йгйги О. О. ТЬе 1во1аноп апд депенс сйагас1епзаИоп о1 тп1ап1ь о! йе 1гур1орйап вунегп о( Вассдиз зиМ!1!з, ОепеИсь, 62, 445 — 460 (1969) . 10 Сой!олдге С., МШег У. Н. ОепеИс з1пд(еь о( йе !ас гергеьвог. !Ч. МШадешс ьресИИу !п йе!ас 1 депе о1 Езсйеггсйа сод У. Мо!. В!о(,, 117, 577 — 606 (1977). 11, Оас!з В. Р, 1ьо!аИоп о1 Ь!осЬеппсапу де1!с!еп! тп1ап1в о1 Ьас1епа Ьу репкййп, Л. Ат.
СЬет. Бос., 70, 4267 (1948). 12. Риего!а У., !лдгалат У. Е, Сегда-О!теда Е, !пднсноп о1 с1оье1уИп1гед тп(пр!е пш1а1юпв Ьу п!1говодпап!д(пе. Ха1пге (валидол), 230, 122 †1 (197!). 13. Вопд У., Атез В. У. 1.оса!!хед пш(адепези о1 апу ьресИ!с мпаП гед1оп о1 йе Ьас1епа! сйгогпоьоте. Ргос. Хап, Асад. Бс!.
О.Б.А., 68, 3158 †31 (1971). !4 Кияйлег Б. В., Мал(ез Ч. Е., Сяатрлеу йг. Б. Сопгппопа1у 1е1Ьа! г!Ьовота! рго1е!п гпп1ап1я: сйагас1егйапоп о1 а 1оспв геап!гед (ог тогйпсапоп о( 505 ьпЬппИ рго1е1пв. Ргос, Хап, Асад. Бей (У.Б.А., 74, 467 †! (!977). 15. ЕедегЬегд У. Ое(есноп о1 (еггпеп(а1йе чапапй тч1!Ь 1е1гахопшп. д. Вас1епо1., 56, 695 (1948). !6. У.едегЬегд У. 1во1аиоп апд сйагас1ег!хаИоп о( Ь!осйеппса) гпц(апй о1 Ьас1епа. Мейодя Мед.
Йев., 3, 5 — 22 (1950). 17. ЕедегЬегд У., ЕедсгЬсгд Е. М. Рсрйса р1аИпд апд гпгигес( ье1еспоп о1 Ьас(епа1 тп!ап1ь. Л. Вас(епо!., 63, 399 — 406 (1952). 18. Еедегбегд У., 2!лдег У. О. Сопсеп1гаИоп о1 Ыосйет!са( пш1апй о( Ьас1ег!а (и!!Ь решсИ1!п. Л. Атег. СЬепь Бос., 70, 4267 — 4268 (1948). 19.
Мрдег Е С., М!!!ег У. А. ТЬе птйадепкцу о! сйет!са! саге!подепь: согге!аИопв, ргоЫегпь апд !п1егрге(аИопв, р. 83 — 119.!п А. Нопаеп- 63 ЧАСТЬ !11. ГЕНЕТИКА 8ег (ег).), СЬеписа! пш1аеепа, чо). 1, Рг!пс(р!еа ап8 ше!Ьойа 1ог 1Ье!г 4е1ес1!оп. Р!еппги Ргеаа, Йеег 'гог)г (1971). 20. Лгоо!сй й. Р. Вх(гасЬгоп1оаогпа! !ппег!1апсе 1и Ьас(ег(а. Вас1егю!.
меч., ЗЗ, 210 — 263 (1969). 21. Огас!ои 8. Аг., Огах1ои М, К., Сйои О. !ао1а1юп о1 ароп1апеооа пш(ап1 Ыга)па о1 Раеиг(отоигхг ройала. ВюсЬеш. В!орЬуа. йеа. Совшпп., 38, 179 — 184 (1969). 22. 048оги М., Регьои 5., РА(!!Гра 5., РииА Р. А йе1егш!па1!оп о! шп(аиеп арес!!!с!(у (п Ьас(епа пып2 попаепае пш(ап(а о! Ьас(ег!орЬаЕе Т4. 3. Мо!. Вю!., 28, 437 — 447 (! 967). 23, Ргаиах8 (., 5аеттап Р. Ми(аиеп!с ьресЛ(сВу: гечегйгш о! !ао-1- су1осЬгоп1е с пш1ап(а о! уеаеЬ Л. Мо!. В(о1., 79, 66 — 82 (1973). 24. 5ар8а!аА! Пг.
М1сгоЫа1 ае1ес(юп. 1. бган!еп1 р)а1е 1ссЬпг9пе !ог а1пйу о! Ьас(ег!а! геяйапсе, Яс!епсе, 116, 46 — 48 (1962), 25. Угг!!е(я Х 5., С(игй А. Х., Вов К. В. Оепе1гс !осаВоп о! сег1а!п гиЫаВопа соп!егПиЕ гесоп1Ыпа1!оп 4ейс!епсу !и ЕхсАег!сА!и со!!. Л. Вас1ег!о!., 97, 244 — 249 (1969). Глава 14 ПЕРЕНОС ГЕНОВ Р.
Кертис ПУ Обычно рассматривают три типа переноса генов у бактерий. Первый тип — трансформация — это такой процесс, при котором ДНК одной бактерии — донора переходит в другую бактерию — реципиент. Реципиентная клетка, в которой происходит экспрессия генетических признаков донора, называется трансформантом. Второй тип — трансдукция — это процесс генного переноса, при котором бактериальный вирус (бактериофаг), размножающийся в клетках бактериального штамма-донора, включает в себя часть генетической информации бактерии и после инфицирования другого, реципиентного, штамма вызывает иногда наследуемые изменения у последнего.
Реципиентная клетка, которая таким путем приобретает признаки донора, называется трансдуктантом. Третий тип переноса — конвюгация — это процесс, при котором клетки бактериального штамма-донора вступают в непосредственный механический контакт с клетками реципиентного штамма и передают последнему генетический материал. Реципиент, который получает этот материал, называется трансконъюгантом. Наряду с процессом мутирования генов трансформация, трансдукция и конъюгация играют важную роль в появлении новых типов бактерий. Эти процессы очень важны также потому, что они позволяют исследователям, занимающимся бактериальной генетикой, выяснять биохимические и генетические аспекты функционирования бактерий, устанавливать принципы строеяия, функционирования и регуляции генов, а также более сложных процессов синтеза макромолекул, роста и деления клеток.
14.1. ТРАНСФОРМАЦИЯ Трансформация хорошо известна и подробно изучена для некоторых штаммов 31гер1ососсаз рпеитоп1ае, НаеторИ1из гп1!иепзае, Вас!1!из зиЬ11!1з, 31гергососсиз зап- ЧАСТЬ !!!. ГЕНЕТИКА ди1з, )че1ззег!а уопоггйоеае, Ас1пе1обас1ег са1соасебсиз 1'25, 31, 361. Способность или неспособность к трансформации для любого бактериального штамма зависит от его компетентности, под которой понимают способность реципиентного штамма включать ДНК из культуральной среды внутрь клетки.
Трансфекция — процесс, аналогичный трансформации, при котором выделенная ДНК бактериального вируса, будучи внесенной в культуру компетентного реципиента, обусловливает образование фиговых частиц. В тех случаях, когда в компетентную реципиентную клетку не попадает фаговый геном весь целиком, для его образования необходимо, чтобы в клетке-реципиенте прошла рекомбииация проникших в нее нескольких неполных фаговых хромосом. Успешное осуществление трансформации определяется использованием высокомолекулярной двухцепочечной ДНК и созданием специфичных условий, в которых популяция реципиентных клеток проявляет максимальную компетентность.
Последнее часто зависит от таких факторов, как стадия в цикле роста популяции реципиента, питательная ценность культуральной среды, уровень аэрации, рН, наличие нужных концентраций двухвалентных катионов и в большинстве случаев генотип реципиента. В отношении последнего свойства среди наиболее важных моментов укажем структуру клеточной поверхности, образование факторов компетентности, способяость подвергаться автолизу и присутствие нли отсутствие профагов (умеренных бактериальных вирусов, геном которых реплицируется синхронно с геномом бактерии-хозяина). При изучении трансформации необходимо, чтобы штаммы донора и реципиента различались по легко распознаваемым генетическим признакам. Как правило, используются реципиенты, несущие мутации, которые обусловливают неспособность синтезировать какой-либо метаболнт или утилизировать какой-либо источник углерода, или же реципиенты с признаками дикого типа, чувствительные к некоторым антибиотикам, химическим препаратам или фагам.
Доноры же должны иметь противоположные аллели, которые легко выявля- Ы. ПЕРЕНОС ГЕНОВ ются в том случае, если трансформант их унаследовал. Методы выделения и определения характеристик мутаитных штаммов описаны в гл. 13. 14.1.1. Выделение ДНК Оптимальный метод выделения высокомолекулярной ДНК из донорного штамма или трансфецирующей ДНК бактериального вируса часто зависит от особенностей соответствующих бактерий или вирусов. Общие принципы и методы разрушения клеток грамотрицательных и грамположительных бактерий с целью выделения ДНК приведены в гл. 22.
Чаще других для выделения и очистки высокомолекулярной ДНК из микроорганизмов применяется метод, описанный Мармуром [291. Он подробно изложен в равд, 22.2.1. Однако в большинстве случаев использование высокоочищенных препаратов ДНК, не содержащих РНК н другие примеси, необязательно; поэтому можно обойтись без обработки рибонуклеазой. Специальные методы выделения ДНК плазмид описаны в гл. 15. Для всех методов выделения ДНК характерна обязательная инактивация бактериальных дезоксирибонуклеаз.
В связи с этим трансформирующую ДНК обычно суспендируют в буфере, содержащем соли лимонной кислоты или натриевую соль ЗДТА. Зти соли образуют хелатные комплексы с двухвалентными катионами, такими, как магний, представляющими собой необходимые кофакторы для большинства дезоксирнбонуклеаз. Препараты ДНК обычно хранят в стандартном цитратносолевом буфере (0,15 М ИаС1, 0,015 М трехзамещенный цитрат натрия, рН 7,0) или, в случае плазмидных и фаговых ДНК, для которых важно поддержание суперспирализованной кольцевой конфигурации, в буфере 10 мМ трио — 1мМ ЭДТА, рН 8,0.
!4.1.2. Количественное определение ДИК Количество очищенной ДНК (не содержащей РНК и других примесей, поглощающих в ультрафиолете) можно определить, измерив ее концентрацию спектрофотометрически. Оптическая плотность при 260 нм в кю- бт часть пь гвнвтикл веге с длиной оптического пути 1 см, поделенная на 20, дает концентрацию ДНК в мг/мл. Таким образом, для концентрации ДНК 50 мкг/мл А~~О=1,0. Для оценки чистоты препарата ДНК можно измерять оптическую плотность при 234, 270 и 280 нм и соотносить ее с оптической плотностью при 260 нм (равд. 22.4). Для количественной сценки неочищенной ДНК можно использовать цветную пробу с дифениламином, детально описанную в равд.
22.4.3. Концентрацию ДНК в препарате, предназначенном для опытов по трансформации, можно измерить также по радиоактивной метке, включив в ДНК меченый тимидии до определенного уровня. При этом нужно, чтобы доиориый штамм имел мутацию йуА, при которой блокируется эндогенный синтез тимидинмоиофосфата; желательно также наличие мутаций деоВ или деоС, обусловливающих предотвращение распада дезоксирибозо-1-фосфата. Процесс мечения ДНК включает следующие процедуры: 1. В подходящую минимальную среду, такую, как среда ЧВ-Е (равд. 14.4.6), добавляют казамииовые кислоты без витаминов (до 0,5а/а, равд.
14.4.8). 2. Туда же вносят 5,0 мкКи ыС-тимидина или 'Н-тимидииа и столько иемеченого тимидина, чтобы общая концентрация его составила 4,0 мкг/мл. 3. Добавляют в среду клетки йуА деоВ из расчета 10' клетка/мл и иикубируют культуру столько времени, чтобы клетки успели пройти 7 или больше делений. 4. Выделяют ДНК. 5. Наносят две одинаковые пробы ДНК объемом 25 мкл на диски фильтровальиой бумаги и/па1шап ЗММ, наколотые иа булавки из нержавеющей стали. Не ранее чем через 1 мин опускают фильтры в стакан с 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) для осаждения ДНК при комнатной температуре.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
