Главная » Просмотр файлов » Методы общей бактериологии (том 2)

Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 8

Файл №947293 Методы общей бактериологии (том 2) (Методы общей бактериологии в трех томах (ред. Герхардт)) 8 страницаМетоды общей бактериологии (том 2) (947293) страница 82013-09-15СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 8)

13.7.1. Природа изменений ДИК Некоторые представления о природе изменений ДНК часто можно получить с помощью анализа обратных мутаций, описанного в равд. 13.5.2. Если обратная мутация вызывается любым мутагеном, можно заключить, что это точковая мутация, а не делеция или другая хро- ленную аминокислоту, могут иметь нарушения в одной нз нескольких последовательных ферментативных реакций, ведущих к синтезу этой аминокислоты. Морфологические мутанты или мутанты с изменениями в синтезе макромолекул могут иметь модификации в еще более широком классе функций, например на этапе сборки нли регуляции. Хотя в задачу настоящей главы не входит детальное описание множества возможных подходов к изучению природы мутантов, ниже приводится несколько основных способов анализа, которые могут быть полезны в работе.

ЧАСТЬ ИЬ ГЕНЕТИКА мосомная аберрация. Если обратная мутация ускоряется аналогами оснований, ЭМС или гидроксиламином, возможен предварительный вывод о замене оснований, вероятно, по типу транзиции. Если же скорость обратной мутации возрастает под действием такого мутагена, как 1СК-191, то скорее всего мутация представляет собой сдвиг рамки. Ускорение обратной мутации такими факторами, как ультрафиолет, при отсутствии эффекта других мутагенов указывает на мутацию по типу транс- версии (см, предупреждение в равд. 13.2).

Частота спонтанной реверсии — также важный параметр, так как он является мерой генетической стабильности мутации. Это свойство может быть важным критерием в оценке пригодности данной мутации для последующих физиологических или биохимических исследований. 13.7.2. Полнота генетического блока Второй критерий, определяющий ценность отдельной мутации — это степень инактивации гена, в котором произошла мутация. Частичное сохранение функции часто встречается в случае мутации с заменой оснований и значительно регке при сдвигах рамки или делециях.

Степень полноты мутации легко оценить по скорости роста или другим проявлениям свойств, высевая клетки мутанта с низкой плотностью на селектнвную или непермиссивную среду. Неполнота мутации может стать проблемой в работе с мутантами, которые должны использоваться в других физиологических экспериментах, связанных, например, с исследованием активности ферментов, или в сопряженных с другими мутантами тест-системах.

13.7.3. Физиологические механизмы генетического блока Для мутантов, дефектных по одному из нескольких генов, которые кодируют ферменты, участвующие в одной цепи биохимических реакций, природу дефекта часто можно выяснить, сопоставляя зависимость роста от тех или иных факторов с накоплением промежуточных продуктов. В идеальном случае для любой последователь- ! 2 3 и ности биохимических реакций Х вЂ” +.А — э. — ~С вЂ” +.КН (Х, А, В, С вЂ” промежуточные продукты, КП вЂ” конечный продукт) мутанты, заблокированные на любом из этапов, должны отвечать (т. е, расти) на любой способный продиффундировать в клетку промежуточный продукт реакции, образующийся за местом блока. При этом промежуточные продукты, образующиеся непосредственно перед местом блока, будут накапливаться в ростовой среде.

Так, для приведенной гипотетической последовательности мутант по гену, кодирующему фермент 1, будет накапливать промежуточный продукт Х и расти при добавлении продуктов А, В или С, не говоря уже о КП. Мутант, дефектный по ферменту 2, будет накапливать промежуточный продукт А (и, возможно, Х) и расти при добавлении В, С или КП. На практике изучение природы мутантов по накоплению продуктов и по выявлению зависимости роста от добавок ограничено несколькими факторами. Во-первых, многие продукты не могут проникнуть в клетку. Обычно, например, клеткам недоступны фосфорилированные промежуточные продукты, которые, таким образом, не могут использоваться для нормализации роста путем добавления к среде (обычно они синтезируются внутри клетки). Во-вторых, некоторые промежуточные продукты химически нестабильны и быстро деградируют до других соединений, некоторые метаболизируются другими ферментными системами.

В-третьих, нужные промежуточные продукты иногда малодоступны или отсутствуют простые методы их выявления (например, невозможно колориметрическое определение и др.). Несмотря на указанные ограничения, исследование зависимости роста от добавления промежуточного продукта и накопления соответствующего продукта может оказаться чрезвычайно полезным при идентификации различных генетических и ферментативных функций в биосинтезе аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований и витаминов. 13.8. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРИЛОЖЕНИЯ Индукция мутаций и выделение мутантов — важные этапы, лежащие в основе использования мутантов тем или иным способом.

В последние годы широкое распро- 43 ЧАСТЬ П1, ГЕНЕТИКА странение и значение приобрели две специальные разновидности применения мутагенеза, Это метод локального мутагенеза, позволяющий специфично получать мутации в ограниченном участке бактериального генома, и проба на мутагенез по Эймсу, прн помощи которой можно выявить потенциальную канцерогенную активность неизвестного вещества, измерив его мутагенность в бактериальной тест-системе. 13.8.1. Локальный мутагенез Метод локального мутагенеза, предложенный в 1971 г. Хонгом и Эймсом 1131, позволяет выделять мутанты с вновь индуцированными мутациями, локализованными в небольшой области бактериальной хромосомы. Мутации индуцируются в коротком отрезке ДНК бактерии, который содержится в трансдуцирующем бактериофаге, и затем обнаруживаются в клетках, подвергшихся трансдукции, отбором по близко сцепленному маркеру.

Таким способом можно селективно получать мутации в области, составляющей около 1$ бактериальной хромосомы. В приводимом ниже описании метода осуществляющий общую трансдукцию фаг Р1 Е. со(1 подвергают мутагенезу обработкой гидроксиламином, химическим агентом, который производит транзиции типа бС вЂ” эАТ. После этого фаг используют для трансдукции реципиентного штамма, имеющего генетический дефект на одном из ранних этапов биосинтеза ароматических аминокислот (агоЕ). Трансдуктанты проверяются затем на наличие новых мутаций либо в одном из близко расположенных генов устойчивости к лекарственным препаратам (стрептомицин илн спектиномицин), либо в различных генах рибосомных белков.

Последние мутации легко выявляются как температурочувствительные условно летальные мутации [141. Метод приготовления трансдуцируюсцего бактериофага 1. Смешивают около 10' частиц фага Р1 о1г с 0,5 мл культуры (1 — 2 10' клетка/мл) дикого штамма Е. со(1 (агоЕ1 ), находящегося в середине логарифмической 44 фазы роста в 1.-бульоне (равд. 13.9.!).

Это делают в пробирке, куда предварительно вносят 3 мл расплавленного и остуженного (.С-агара (равд. 13.9.17), используемого затем для формирования верхнего слоя среды в чашке. 2. Выливают смесь на поверхность свежеприготовленного нижнего слоя 1С-агара (равд. 13.9.18) в чашки и инкубируют в течение ночи при 37'С. 3.

Снимают верхний слой агара стерильной лопаточкой в пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащей 0,5 мл хлороформа. 4. Промывают поверхность оставшегося в чашке агара 2 мл !.-бульона (равд. 13.9.1), добавляют смыв к собранному в пробирку агару и интенсивно встряхива ют. 5. Смесь центрифугируют при 5000 — 6000 8 на настольной центрифуге в течение !5 мин. Надосадочную жидкость удаляют пастеровской пипеткой н переносят в стерильную пробирку с несколькими каплями хлороформа. Метод титроеания и мутагенеза трансдуцируюи(его фага 1. Выращивают культуру Е.

со(! АВ1157 до приблизительной концентрации 2 10" клетка/мл в Е-бульоне (равд. 13.9.1), центрнфугнруют и ресуспендируют полученные клетки в половине объема 1.-бульона. 2. Смешивают 0,1 мл этой клеточной суспензии с 0,1 мл разных разведений фаголизата (10-', 10-', 10 ") в (.-бульоне. Для обеспечения адсорбции фага инкубнруют пробы 20 мин при 37'С. 3. Добавляют 1,5 мл расплавленного 1 С-агара (равд. 13.9.17), охлажденного до температуры 55'С, смешивают быстрым вращением пробирки между ладонямн и выливают в чашки на поверхность свежеприготовленного и застывшего нижнего слоя 1 С-агара (равд. 13.9.18). 4. Инкубируют чашки в течение ночи при 37'С и на следующий день подсчитывают число стерильных пятен. 5. Концентрируют фаг, находящийся в лизате, центрифугированием при 48 000 д в течение 3 ч. 45 ЧАСТЬ 1Ц.

ГЕНЕТИКА 6. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в небольшом объеме 1-бульона и оставляют на ночь при 4'С. 7. На следующий день суспензию центрифугируют при 15000 д в течение 10 мин и осадок удаляют. 8. Вновь титруют раствор с фагом, как это было сделано ранее на этапах с 2-го по 4-й. 9. Концентрированную суспензию с фагом (10" пятнообразующих единиц в 1 мл) разводят в 10 раз раствором, содержащим 0,45 М гидроксиламин, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ СаС!м и инкубируют 1Π— 14 ч при 37'С. 10.

Смесь центрифугируют при 48000 д в течение 1 ч для осаждения фага. Осторожно ресуспендируют осадок в 0,1 объема (.-бульона, содержащего 2 мМ ЭДТА и 10 мМ СаС1ь 11. Для удаления загрязнений суспензию центрифугируют при 15000 д в течение !О мин и отделяют от осадка надосадочную жидкость, в которой содержится бактериофаг. В условиях опыта жизнеспособность фага снижается примерно на 4 порядка. 12.

Вновь титруют фаг, как описано выше. Осуществление грансдукции 1. Для осуществления трансдукции [25! выращивают реципиентный штамм (Е. сой АВ2834 агоЕ) в 1-бульоне (равд. 13.9.1) при 37'С до конечной концентрации 1.!0' клетка/мл. 2. Клетки осаждают центрифугированием суспензии при 6000 д и ресуспендируют их в 0,1 объема 1.-бульона. 3. Смешивают 0,5 мл суспензии бактериальных клеток ( — 5.10' клеток), 0,5 мл суспензии исходного подвергнутого мутагенезу фага ( -5.10' пятнообразующих единиц в 1 мл) и 0,5 мл раствора 0,015 М СаС12 и 0,03 М МцЗОа. 4.

Смесь инкубируют при 37'С в течение 20 мин, центрифугируют ее и дважды промывают клетки буфером М56/2 (равд. 13.9.9). 5. Ресуспендируют клетки в 1 мл буфера М56/2 и вносят аликвоты объемом 0,2 мл в чашки с минимальным агаром (равд. 13.9.10), содержащим 0,2те глюкозы и О,ЗА7е казаминовых кислот, очищенных от примесей 46 !3. МУТАЦИИ окрашивающих веществ. (Смешивают 3 г !4ог(1 А с 20 г казаминовых кислот, не содержащих витаминов, в 200 мл воды. Частицы активированного угля удаляют фильтрацией под вакуумом.

Характеристики

Тип файла
DJVU-файл
Размер
4,16 Mb
Тип материала
Предмет
Учебное заведение
Неизвестно

Список файлов книги

Свежие статьи
Популярно сейчас
А знаете ли Вы, что из года в год задания практически не меняются? Математика, преподаваемая в учебных заведениях, никак не менялась минимум 30 лет. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6559
Авторов
на СтудИзбе
299
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее