Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 8
Текст из файла (страница 8)
13.7.1. Природа изменений ДИК Некоторые представления о природе изменений ДНК часто можно получить с помощью анализа обратных мутаций, описанного в равд. 13.5.2. Если обратная мутация вызывается любым мутагеном, можно заключить, что это точковая мутация, а не делеция или другая хро- ленную аминокислоту, могут иметь нарушения в одной нз нескольких последовательных ферментативных реакций, ведущих к синтезу этой аминокислоты. Морфологические мутанты или мутанты с изменениями в синтезе макромолекул могут иметь модификации в еще более широком классе функций, например на этапе сборки нли регуляции. Хотя в задачу настоящей главы не входит детальное описание множества возможных подходов к изучению природы мутантов, ниже приводится несколько основных способов анализа, которые могут быть полезны в работе.
ЧАСТЬ ИЬ ГЕНЕТИКА мосомная аберрация. Если обратная мутация ускоряется аналогами оснований, ЭМС или гидроксиламином, возможен предварительный вывод о замене оснований, вероятно, по типу транзиции. Если же скорость обратной мутации возрастает под действием такого мутагена, как 1СК-191, то скорее всего мутация представляет собой сдвиг рамки. Ускорение обратной мутации такими факторами, как ультрафиолет, при отсутствии эффекта других мутагенов указывает на мутацию по типу транс- версии (см, предупреждение в равд. 13.2).
Частота спонтанной реверсии — также важный параметр, так как он является мерой генетической стабильности мутации. Это свойство может быть важным критерием в оценке пригодности данной мутации для последующих физиологических или биохимических исследований. 13.7.2. Полнота генетического блока Второй критерий, определяющий ценность отдельной мутации — это степень инактивации гена, в котором произошла мутация. Частичное сохранение функции часто встречается в случае мутации с заменой оснований и значительно регке при сдвигах рамки или делециях.
Степень полноты мутации легко оценить по скорости роста или другим проявлениям свойств, высевая клетки мутанта с низкой плотностью на селектнвную или непермиссивную среду. Неполнота мутации может стать проблемой в работе с мутантами, которые должны использоваться в других физиологических экспериментах, связанных, например, с исследованием активности ферментов, или в сопряженных с другими мутантами тест-системах.
13.7.3. Физиологические механизмы генетического блока Для мутантов, дефектных по одному из нескольких генов, которые кодируют ферменты, участвующие в одной цепи биохимических реакций, природу дефекта часто можно выяснить, сопоставляя зависимость роста от тех или иных факторов с накоплением промежуточных продуктов. В идеальном случае для любой последователь- ! 2 3 и ности биохимических реакций Х вЂ” +.А — э. — ~С вЂ” +.КН (Х, А, В, С вЂ” промежуточные продукты, КП вЂ” конечный продукт) мутанты, заблокированные на любом из этапов, должны отвечать (т. е, расти) на любой способный продиффундировать в клетку промежуточный продукт реакции, образующийся за местом блока. При этом промежуточные продукты, образующиеся непосредственно перед местом блока, будут накапливаться в ростовой среде.
Так, для приведенной гипотетической последовательности мутант по гену, кодирующему фермент 1, будет накапливать промежуточный продукт Х и расти при добавлении продуктов А, В или С, не говоря уже о КП. Мутант, дефектный по ферменту 2, будет накапливать промежуточный продукт А (и, возможно, Х) и расти при добавлении В, С или КП. На практике изучение природы мутантов по накоплению продуктов и по выявлению зависимости роста от добавок ограничено несколькими факторами. Во-первых, многие продукты не могут проникнуть в клетку. Обычно, например, клеткам недоступны фосфорилированные промежуточные продукты, которые, таким образом, не могут использоваться для нормализации роста путем добавления к среде (обычно они синтезируются внутри клетки). Во-вторых, некоторые промежуточные продукты химически нестабильны и быстро деградируют до других соединений, некоторые метаболизируются другими ферментными системами.
В-третьих, нужные промежуточные продукты иногда малодоступны или отсутствуют простые методы их выявления (например, невозможно колориметрическое определение и др.). Несмотря на указанные ограничения, исследование зависимости роста от добавления промежуточного продукта и накопления соответствующего продукта может оказаться чрезвычайно полезным при идентификации различных генетических и ферментативных функций в биосинтезе аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований и витаминов. 13.8. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРИЛОЖЕНИЯ Индукция мутаций и выделение мутантов — важные этапы, лежащие в основе использования мутантов тем или иным способом.
В последние годы широкое распро- 43 ЧАСТЬ П1, ГЕНЕТИКА странение и значение приобрели две специальные разновидности применения мутагенеза, Это метод локального мутагенеза, позволяющий специфично получать мутации в ограниченном участке бактериального генома, и проба на мутагенез по Эймсу, прн помощи которой можно выявить потенциальную канцерогенную активность неизвестного вещества, измерив его мутагенность в бактериальной тест-системе. 13.8.1. Локальный мутагенез Метод локального мутагенеза, предложенный в 1971 г. Хонгом и Эймсом 1131, позволяет выделять мутанты с вновь индуцированными мутациями, локализованными в небольшой области бактериальной хромосомы. Мутации индуцируются в коротком отрезке ДНК бактерии, который содержится в трансдуцирующем бактериофаге, и затем обнаруживаются в клетках, подвергшихся трансдукции, отбором по близко сцепленному маркеру.
Таким способом можно селективно получать мутации в области, составляющей около 1$ бактериальной хромосомы. В приводимом ниже описании метода осуществляющий общую трансдукцию фаг Р1 Е. со(1 подвергают мутагенезу обработкой гидроксиламином, химическим агентом, который производит транзиции типа бС вЂ” эАТ. После этого фаг используют для трансдукции реципиентного штамма, имеющего генетический дефект на одном из ранних этапов биосинтеза ароматических аминокислот (агоЕ). Трансдуктанты проверяются затем на наличие новых мутаций либо в одном из близко расположенных генов устойчивости к лекарственным препаратам (стрептомицин илн спектиномицин), либо в различных генах рибосомных белков.
Последние мутации легко выявляются как температурочувствительные условно летальные мутации [141. Метод приготовления трансдуцируюсцего бактериофага 1. Смешивают около 10' частиц фага Р1 о1г с 0,5 мл культуры (1 — 2 10' клетка/мл) дикого штамма Е. со(1 (агоЕ1 ), находящегося в середине логарифмической 44 фазы роста в 1.-бульоне (равд. 13.9.!).
Это делают в пробирке, куда предварительно вносят 3 мл расплавленного и остуженного (.С-агара (равд. 13.9.17), используемого затем для формирования верхнего слоя среды в чашке. 2. Выливают смесь на поверхность свежеприготовленного нижнего слоя 1С-агара (равд. 13.9.18) в чашки и инкубируют в течение ночи при 37'С. 3.
Снимают верхний слой агара стерильной лопаточкой в пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащей 0,5 мл хлороформа. 4. Промывают поверхность оставшегося в чашке агара 2 мл !.-бульона (равд. 13.9.1), добавляют смыв к собранному в пробирку агару и интенсивно встряхива ют. 5. Смесь центрифугируют при 5000 — 6000 8 на настольной центрифуге в течение !5 мин. Надосадочную жидкость удаляют пастеровской пипеткой н переносят в стерильную пробирку с несколькими каплями хлороформа. Метод титроеания и мутагенеза трансдуцируюи(его фага 1. Выращивают культуру Е.
со(! АВ1157 до приблизительной концентрации 2 10" клетка/мл в Е-бульоне (равд. 13.9.1), центрнфугнруют и ресуспендируют полученные клетки в половине объема 1.-бульона. 2. Смешивают 0,1 мл этой клеточной суспензии с 0,1 мл разных разведений фаголизата (10-', 10-', 10 ") в (.-бульоне. Для обеспечения адсорбции фага инкубнруют пробы 20 мин при 37'С. 3. Добавляют 1,5 мл расплавленного 1 С-агара (равд. 13.9.17), охлажденного до температуры 55'С, смешивают быстрым вращением пробирки между ладонямн и выливают в чашки на поверхность свежеприготовленного и застывшего нижнего слоя 1 С-агара (равд. 13.9.18). 4. Инкубируют чашки в течение ночи при 37'С и на следующий день подсчитывают число стерильных пятен. 5. Концентрируют фаг, находящийся в лизате, центрифугированием при 48 000 д в течение 3 ч. 45 ЧАСТЬ 1Ц.
ГЕНЕТИКА 6. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в небольшом объеме 1-бульона и оставляют на ночь при 4'С. 7. На следующий день суспензию центрифугируют при 15000 д в течение 10 мин и осадок удаляют. 8. Вновь титруют раствор с фагом, как это было сделано ранее на этапах с 2-го по 4-й. 9. Концентрированную суспензию с фагом (10" пятнообразующих единиц в 1 мл) разводят в 10 раз раствором, содержащим 0,45 М гидроксиламин, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ СаС!м и инкубируют 1Π— 14 ч при 37'С. 10.
Смесь центрифугируют при 48000 д в течение 1 ч для осаждения фага. Осторожно ресуспендируют осадок в 0,1 объема (.-бульона, содержащего 2 мМ ЭДТА и 10 мМ СаС1ь 11. Для удаления загрязнений суспензию центрифугируют при 15000 д в течение !О мин и отделяют от осадка надосадочную жидкость, в которой содержится бактериофаг. В условиях опыта жизнеспособность фага снижается примерно на 4 порядка. 12.
Вновь титруют фаг, как описано выше. Осуществление грансдукции 1. Для осуществления трансдукции [25! выращивают реципиентный штамм (Е. сой АВ2834 агоЕ) в 1-бульоне (равд. 13.9.1) при 37'С до конечной концентрации 1.!0' клетка/мл. 2. Клетки осаждают центрифугированием суспензии при 6000 д и ресуспендируют их в 0,1 объема 1.-бульона. 3. Смешивают 0,5 мл суспензии бактериальных клеток ( — 5.10' клеток), 0,5 мл суспензии исходного подвергнутого мутагенезу фага ( -5.10' пятнообразующих единиц в 1 мл) и 0,5 мл раствора 0,015 М СаС12 и 0,03 М МцЗОа. 4.
Смесь инкубируют при 37'С в течение 20 мин, центрифугируют ее и дважды промывают клетки буфером М56/2 (равд. 13.9.9). 5. Ресуспендируют клетки в 1 мл буфера М56/2 и вносят аликвоты объемом 0,2 мл в чашки с минимальным агаром (равд. 13.9.10), содержащим 0,2те глюкозы и О,ЗА7е казаминовых кислот, очищенных от примесей 46 !3. МУТАЦИИ окрашивающих веществ. (Смешивают 3 г !4ог(1 А с 20 г казаминовых кислот, не содержащих витаминов, в 200 мл воды. Частицы активированного угля удаляют фильтрацией под вакуумом.