Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Обычно эта зависимость соблюдается; лишь в области высоких концентраций ДНК может наступать насыщение. 12. Вычисляют частоту котрансформации аллелей /грА23 и !ГрВ+ и определяют, насколько эта величина постоянна и не зависит от концентрации ДНК. чАсть пь Генктикх Модификации и другие эксперименты ао трансформации с А. са!спасе(Гсиз Вышеописанный метод можно сделать количественным, если добавлять известные количества донорной ДНК (1 — 500 нг/мл) к жидким культурам компетентных реципиентных клеток с концентрацией 1-10' — 2 1О' клетка/мл.
После инкубации в течение 10 †мин при 35'С для остановки реакции добавляют на 1 мл смеси 10 мкл ДНКазы, растворенной в 1 М МаС!~ в концентрации 0,5 мг/мл. Соответствующие разведения высевают на селективную среду и затем строят график зависимости абсолютного титра трансформантов от концентрации ДНК в логарифмических координатах. Можно также определить стадию в цикле роста культуры, когда компетентность реципиента максимальна, Для этого вносят небольшие изменения в метод простой трансформации в чашке или применяют более количественный метод, описанный в предыдущем абзаце. В таком эксперименте следует в каждой пробе использовать одну и ту же концентрацию (или число) клеток реципиента. Для повышения точности такого эксперимента прежде всего нужно построить кривую роста реципиентного штамма в (.-бульоне (равд.
14.4.1) при 35'С с аэрацией. В общих чертах методика определения зависимости частоты трансформации от стадии роста заключается в следующем. Клетки стационарной проинкубированной с аэрацией в течение ночи культуры осаждают центрифугированием и суспендируют в той же концентрации в свежем 1.-бульоне. Титр суспензии определяют посевом соответствующего разведения на (.-агар (равд.
14,4.1). Делают разведения суспензни 1: 5, 1: 10, 1: 20, 1: 40 и 1: 80 в колбах с 1.-бульоном и инкубируют при 35'С со встряхиванием. Через 15 и 30 мин отбирают пробы из разведения 1: 5 и добавляют к ним донорную ДНК в насыщающей концентрации; эти пробы служат для оценки компетентности клеток в ранней, средней и поздней лаг-фазе. Пробы из разведений 1: 1О, 1: 20, 1: 40 и 1; 80 отбирают по достижении той оптической плотности, которая характерна для исходной культуры, разведенной 1:5; по ним оцениваются различные стадии логарифмической фазы роста.
Культуру разведения 1: 80 !Е ПЕРЕНОС ГЕНОВ можно дорастить до больших плотностей, чтобы оценить компетентность клеток в поздней логарифмической, ранней стационарной н стационарной фазах. Однако перед добавлением ДНК такие пробы разводят до соответствующей стандартной плотности. К моменту добавления донорной ДНК для каждой пробы должно быть подсчитано число жизнеспособных реципиентных клеток.
Зная эти цифры и начальные разведения, строят кривую роста и на этом же графике откладывают для каждой точки частоту трансформации. Максимум компетентности должен находиться в интервалах от поздней лаг- до ранней логарифмической фазы и от поздней логарифмической до ранней стационарной фазы. Для определения в популяции реципиента абсолютного количества компетентных клеток, способных включать ДНК донора, используют радиоактивно меченную донорную ДНК с последующей радиоавтографией или математический анализ данных, касающихся зависимости частот трансформации двух несцеплеиных донорных маркеров, совместно и порознь, от концентрации ДНК донора. В общих чертах этн методы обсуждаются в работах Хейеса 118~, а также Нотани и Сетлоу 13Ц.
14.!.4. Трансформация у Е. са11 Мандель и Хита 128] обнаружили, что обработка клеток Е. сой СаС!э с последующими инкубацией на холоду и тепловым шоком приводит к включению ДНК, добавленной в среду. Их результаты дали толчок к разработке ряда приемов, позволяющих индуцировать состояние компетентности у бактерий различных родов и тем самым осуществлять трансформацию хромосомной и плазмидной ДНК, а также реализовать возможность трансфекцин с помощью ДНК бактерпофагов. Бантериальные шта ямы В табл.
14.1 перечнслены пзтаммы Е. сой К-!2, которые могут служить донорами и рециписнтами в экспериментах по трансформации, а также трансдукции и коньюгации. Помимо генотипических различий между штаммами донора и реципиента, часто для улучшения спо- 75 чйсть нн ГвнвтнкА Таблица 14.1. Штаммм Е, соп К-12' Другие ю. полшуе- мые обоз- начени» Номер штамма Тнп конан» гации Генотип б 22239 РТА[3[рМВ; .Тпз; Се[-гтт+ 1е[е 5!аз) !зирЕ42Л1зи.5 ргоВ598(!асХОР[)69 Мх-98 зирЕ428(уо1-иогВ)40Л гзрЛ206 гуН70 [йг-!б 1зх-63 ригЕ4! зирЕ42Л" Л1грЕ63 йи-53 зг1-2 Ь[ауА57 епбА! тПА9 тс1Е98 сусВ2 сусЛ! 1йг-! ага-14 1еи-б ргоА2 [ас71 Ьх-ЗЗ зир-,37 уа1К2Л вЂ” зусВ15 й!з-4 гесВ2! гесС22 грз1.31 ху1-5 тп-1 агуЕЗ 15Г1 зпрЕ42Л- уа1К2Л— [асг81 зирЕ42Л- ргоС63 зирЕ42А- сусА! Г[4 [ос+(А(ргоВ-[ис)4! знрЕ42Л- сусА1 А(ргоВ-!ас)4! зирЕ42Л- Ьи-53 па[А96 хуИ4 сусВ2 гроВЗ09 сусЛ! К!00-! (с[гг[-1 1е1е са!е ааг[Ае за[' [псГ[1))!зх-63 зирЕ42Л Ьи-53 1узА32 ху1-!4 агу-66 Л- О-йг!еи ргоА !ас ...
ругВ Г !еи-50 зирЕ42Л- грзЕ206 ага-!4 [еи-б ашчб 1опА23 ргоЛ 70 !азу[ Мх-67 ригЕ42 зирЕ44 уа[К2Л- [грЕЗ8 па1А94 грзЛ!09 ху1-5 т1И 1АИ 72087 х[835 )С7623 5 б 7 8 9 Х289 %3! 02 2226 2353 х!30! 10 2[397 2[784 7[[ гОГ[4 Г Г 12 13 14 2433 7585 Х2834 а Перечисленные штаммм были выбрани потому, что опи обладают простейшими комбинациями генетических свойств, позволяющих удобно проиллюстрировать теоретические положения и методы, описываемые в тексте. Не исе перечисленные штамма использовались в моей лаборатории илн проверялись с помощью описанных в тексте методик.
б Генетическая номенкЛатура соответСтвует номенклатуре, предложенной демерецем и др НЧН использованы условные знаки и символы хромосомпых п плазмидных признаков в соответствии с работаии Вахмаи н др ПИ и Новика и др. [Зу[. 70 собности к трансформации используются дополнительные мутации у штаммов реципиента. У Е. со(1 К-12 делеция галактозного оперона (мутации Лда(), как, например, в штамме 2, приводит к удалению галактозы из липополисахарпдной оболочки и значительно усиливает способность штаммов к трансформации плазмидной лл пвгвнос генов ДНК и способность к трансфекции ДНК фага 1л, но не фагов Т1 и Т7.
Мутация епл(А, имеющаяся у штамма 3, приводит к исчезновению периплазматической зндонуклеазы 1 и очень сильно стимулирует трансформацию плазмидной ДНК, но почти не влияет на трансформацию линейными молекулами ДНК. Кослой и Онши !9) обнаружили, что исчезновение зкзонуклеазы лг и экзонуклеазы 1 у штаммов гесВ, гесС, зЬсВ, например у штамма 4, облегчает трансформацию Е.
со(л' хромосомной ДНК и усиливает трансфекцию ДНК фагов Т1 и Т7, но не ДНК фага ь. В то же время эти мутации не влияют или почти не влияют на трансформацию плазмидной ДНК. Среды В качестве комплексных сред используют 1-бульон и 1-агар (разд. 14,4,1) илн бульон и агар Репаззау (разд. 14.4.4). Можно также использовать различные минимальные среды, в том числе среду М9 !41, среду ЧВ-Е !37] и среду М1. 1101. Для превращения среды в твердую добавляют 1,5'/е агара. В зависимости от генотипа используемого реципиентного штамма добавляют дс оптимальных концентраций (табл. 14,4) аминокислоты, пурины, пиримидины и витамины. Источники углерода обычно добавляют в конечной концентрации 0,5е(л (табл.
14.3); концентрация антибиотиков зависит от степени устойчивости, привносимой соответствующими мутациями н (ллли) генами (табл. 14.5). Методы приготовления сред см. в равд. 14.4, Вьлделение ДОК Хромосомную ДНК штаммов донора, таких, как штамм 1 (табл. 14,1), лучше всего выделять по методу Мармура ((291; равд. 22.2.1). Для получения активных в отношении трансформации препаратов ДНК послед. нис агапы выделения, на которых удаляются остатки РНК, проводить не обязательно, ДНК плазмиды рУЛ13 можно выделить из штамма 1 и использовать для трансформации. Плазмидную ДНК выделяют методами, описанными в гл. 15.
77 ЧАСТЬ 1П. ГЕНЕТИКА Осуществление трансформации Описано большое число модификаций оригинальной методики Манделя и Хиги !281. Мы считаем, однако, что наиболее эффективным является метод трансформации или трансфекции разнообразными хромосомными ДНК, а также ДНК фагов и плазмид, разработанный в нашей лаборатории на множестве рсципиентных штаммов Е, со!1 К-12 Гиллом и Александер. Он представляет собой модификацию метода, впервые использованного Эниа с соавторами [151, н ниже мы приводим его описание.
1. Выращивают культуру реципиентного штамма в объеме 5 мл в течение ночи в В-бульоне (равд. 14.4.1) при 37'С без перемешиваиия. Культуры, выращенные без принудительной аэрации, при продолжении культивирования на следующий день имеют значительно более короткую лаг-фазу перед началом экспоненциального роста по сравнению с аэрированными в течение ночи культурами, уже достигшими стационарной фазы роста. 2.
Разводят культуру (1: 100) в 40 мл В-бульона и инкубируют с аэрацией (либо пропусканием пузырьков воздуха, либо встряхиванием) при 37'С до достижения клетками ранней логарифмической фазы (1-!О'— 2 10' клетка/мл). 3. Охлаждают культуру во льду и осаждают клетки центрифугированием при 7000 а при 4'С. 4.
Осторожно суспендируют клеточный осадок в 10 мл охлажденного во льду буфера, имеющего состав: 10 мМ 5(аС!, 50 мМ МпС1м 10 мМ ацетат натрия, рН5,6. 5. Оставля1от суспензию во льду на 20 мин и затем осаждают клетки центрифугированием. 6. Осторожно суспендируют клеточный осадок в !— 2 мл охлажденного во льду буфера, имеющего следующий состав; 75 мМ СаС!ь 100 мМ МпС!м 10 мМ ацетат натрия, рН 5,6.
(В зависимости от конкретного штамма реципиента и типа используемой ДНК можно изменять концентрацию СаС!, в пределах от 25 до 100 мМ и концентрацию МИС!, от 50 до 200 мМ.) 7. Вносят пробы компетентных клеток объемом 200 мкл каждая в охлажденные пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм. 78 !4 ПЕРЕНОС ГЕНОВ 8. Добавляют к каждой пробе компетентных клеток 1 — 10 нг плазмидной илп фаговой ДНК или 100 — 1000 нг хромосомной ДНК.
Если ДНК донора находится е объеме, меньшем чем 20 мкл, то буфер, в котором она растворена, не окажет влияния на результат; однако в случае объема, большего чем 20 мкл, ДНК следует разводить СаС14 — МпС1. — На-ацетатным буфером, рН 5,6, в котором суспенднрованы компетентные клетки. 9. Выдерживак>т смесь, содержащую ДНК и компетентные клетки во льду в холодной комнате в течение примерно 30 мин. 10. Подвергают смесь тепловому шоку при 30'С в течение 2,5 мин. Важна быстрая смена температуры; сама гке температура шока и его длительность различны в зависимости от свойств реципиентного штамма.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
