Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 19
Текст из файла (страница 19)
96 14 ПЕРЕНОС ГЕНОВ Метод общей транедукц4414 Когда используют нелизогенный реципиент, множественность заражения обычно составляет 1 или немного меньше; при этом клетки, зараженные частицами трансдуцирующего фага Р1, уже не заражаются другими частицами того же фага 0 поэтому не теряются вследствие лизиса.
Поскольку адсорбция фага Р1 протекает не очень быстро (при 37'С за 20 — 30 мин, прошедшие после введения, к клеткам прикрепляется только 30 — 50«(е фага), исходное количество фаговых частиц берут из расчета 2 — 3 на одну бактерию; тогда множественность эффективного заражения будет равна 1. В случае использования лизогенного реципиента при повторном заражении клеток фагом выход трансдуктантов не снижается, так как лизогенные клетки иммунны к суперинфицированию фагом Р1 Ь4. Чтобы убедиться в этом, можно добавить Р1 Ь4-лизат родителя-донора к нелизогенному и лизогенному штаммам из расчета 0,5, 2,5 и 12,5 фаговых частиц на одну бактерию.
Последней, наибольшей, множественности заражения достичь довольно трудно, если лизат имеет титр 10" ПОЕ(мл. Трансдукцию в этих случаях осуществляют следующим образом. 1. Выращивают лизогенный и нелизогенный по фагу Р1 йс реципиентные штаммы !ае24 ртоС до плотности 2 10' клетка/мл, как описано выше в «Определении титра фага» (равд. 14.2.2). 2. Пока выращивают рсципиеитные штаммы, некоторое количество Р1 Ь4-лизата донора !асЯ ртоС+ аэрируют при 37'С для удаления остатков СНС1,.
В это же время рассчитывают объем разведенного или неразведенного лизата (обычно 0,1 — 0,5 мл), который при добавлении к отобранному объему реципиентных клеток с концентрацией 2 !О' клетка(мл (обычно 0,5 — 1,9 мл) дает 12,5 ПОЕ на одну бактерию. Затем разводят лизат Р1 Ь4 в Ь-бульоне, содержащем 2,5 мМ СаС1м так чтобы при добавлении фиксированного объема лизата к фиксированному объему реципиентных клеток на одну бактерию приходилось 0,5, 2,5 и 12,5 ПОЕ. 3. Вычисленные объемы бактериальной культуры каждого из реципиентных штаммов вносят в четыре пробирки диаметром 13 и высотой 100 мм и ставят все во- 97 чхсть ш.
Гвнвтикх семь культур инкубироваться при 37'С. Определяют титры реципиентиых культур посевом соответствующих разведений на 1.-агар или агар Репаззау. 4, Добавляют вычисленный объем донорского лизата Р1 1.4 к трем из четырех культур каждого реципиентиого штамма и равный объем (.-бульона+2,5 мМ СаС!е к четвертой культуре, которая служит контролем. Инфицировать культуры лучше всего с 3-мии интервалом, 5. После предварительной адсорбции фага в течение 30 мин ко всем пробам, содержащим смесь фаговых частиц бактерий, добавляют 100 мкл 0,2 М лимоннокислого натрия для хелатирования ионов Са'+ и остановки дальнейшего инфицирования фагом Р1, 6. Вносят аликвоты неразведенных и разведенных в 10 раз проб каждой инфицированной и неинфицированной культуры (100 мкл) в чашки с минимальным агаром ЧВ, содержащим лактозу, соли янтарной кислоты и трифенилтетразолийхлорид. Чашки инкубируют 2 сут при 37'С и затем подсчитывают колонии.
7. Для определения титра выживших клеток делают посев соответствующих разведений зараженных и незараженных культур на 1.-агар или агар Репаззау. Чашки инкубируют при 37'С в течение ночи. 8. Вновь определяют титр Р1 1.4-лизата методом, описанным выше в «Определении титра фага». Это особенно важно при работе с вновь приготовленными лиза- тами Р1, так как иногда в течение первой недели титр возрастает в 2 — 3 раза в результате вызванной хлороформом дезагрегации фаговых частиц, слипающихся из-за присутствия обрывков бактериальных клеток и (или) мельчайших кусочков агара.
9. Чтобы убедиться в отсутствии жизнеспособных клеток донора в лизате Р1 1.4, делают посев 100 мкл последнего на селективный минимальный агар Ъ'В. Когда используют лизогенный по фагу Р1 йс реципиентный штамм, число трансдуктантов пропорционально титру взятого фага, в то время как в случае нелизогенного реципиента число трансдуктантов должно быть меньше при множественности заражения большей единицы, чем при множественности заражения, меньшей или равной единице.
В обоих случаях частота котрансдукции 1асЛ и ргоС+ должна быть одной и той же в РЬ ПЕРЕНОС ГЕНОВ пределах ошибки измерений. Если использовать распределение Пуассона по частоте гибели клеток нелизогенного реципиента для каждого инфицирования, то можно определить фактическую множественность заражения 141.
Применение Общая трансдукцня сыграла большую роль в определении точного расположения генов в бактериальной хромосоме. С этой целью были использованы штаммы, имеющие помимо маркера, по которому вели отбор, два или трн других наследуемых аллеля. С подобными штаммами осуществляли трансдукцию со всеми возможными взаимными комбинациями отбираемого и неотбираемых маркеров.
Для создания штаммов с желаемым генотипом использовали также трансдукцню, опосредуемую фагом Р1. Мутантный аллель с известными свойствами можно котрансдуцировать в какой-либо штамм, ведя отбор по наследованию прилежащего маркера дикого типа. Если котрансдукция невозможна, то мутантные аллели можно ввести трансдукцней фагом Р1 и— после сегрегации и фенотипнческой экспрессии — накопить соответствующие клетки ампициллнн-циклосериновым обогащением. Более новым и более изящным является метод, основанный на переносе факторов устойчивости к лекарственным препаратам (ФУЛП) [71; в этом случае способ отбора клеток, как имеющих, так и не имеющих индуцированные мутации, основан на инактивации генов за счет вставки при переносе ФУЛП.
С помощью модификации этой методики можно располагать способные к переносу ФУЛП в локусах, прилежащих к аллелю дикого типа илн мутировавшему аллелю данного гена, и передавать этот аллель от одного штамма другому. Еще один полезный метод, разработанный Хонгом и Эймсом 120], позволяет индуцировать мутации в неизвестных генах, тесно сцепленных с известными, Обработкой трансдуцирующего фаголизата азотистой кислотой, гндроксилампном нли нитрозогуаиидпиом с последующим отбором при ЗО'С трансдуктаптов, в которых наследуется известный аллель дикого типа, можно с высо- 99 ЧАСТЬ НЬ ГЕНЕТИКА кой частотой получать мутации в генах, определяющих температурочувствительные дефекты в некоторых жизненно важных функциях, причем за эти функции ответственны гены, соседние с аллелем, по которому ведется отбор.
С помощью трансдукции, опосредованной фагом Р1, можно также определить, является тот или иной признак хромосомным или плазмидным по своему происхождению. Р1-Фаголизат, полученный из донорных клеток, облучают возрастающими дозами ультрафиолета, и облученные и необлученные лизаты используют для трансдукцип реципиентному штамму, который затем подвергают отбору на интересующий наследуемый признак донора. Если признак детерминируется хромосомным геном, то малые дозы ультрафиолета будут увеличивать общее число трансдуктантов, так как ультрафиолет повышает частоту рекомбинации; если же признак детерминируется плазмндой, то частота трансдуктантов, наследующих донорский признак, с увеличением дозы ультрафиолета будет уменьшаться, поскольку вызываемые облучением повреждения препятствуют репликации плазмиды после ее переноса в реципиентные клетки путем трансдукции, Наличие производных фага Р1, обладающих способностью переносить ФУЛП, позволяет производить позитивный отбор лизогенных бактерий, присутствующих в относительно малых количествах, и находить новые Р1-трансдуцирующие системы среди других представителей энтеробактерий (ЕН1егоЬас1ег1асеае) 1171.
Можно также отобрать редко встречающиеся производные фага Р1 с более выраженной способностью размножаться в клетках данного штамма или мутанты хозяина, в которых фаг Р1 размножается лучше, чем на других. Фаги, осуществляющие общую трансдукцию, известны для множества родов бактерий. Лучше всего изучена система, в которой используются фаг Р22 и бактерия 5, 7урййпигшт 1391. У нее есть определенные преимущества по сравнению с системой Р1 — Е. со11, заключающиеся в том, что фаг Р22 легко поддается размножения> в жидких лизатах, образует большие стерильные пятна и дает лизаты, остающиеся стабильными годами. Важно также, что эта система позволяет анализировать мутант- 100 РЬ ПЕРЕНОС ГЕНОВ ные аллели на способность дополнять друг друга за счет процесса, называемого абортивной трансдукцией 118, 33) .
14.3. КОНЪЮГАЦИЯ Конъюгация — это тип опосредуемого клеткой переноса генов, который требует наличия у клетки-донора конъюгативной плазмиды. Эта плазмида может реплицироваться или в цитоплазме синхронно с бактериальной хромосомой, или как часть хромосомы в интегрированном с ней состоянии. Конъюгативиые плазмиды обладают генами 1га, которые определяют и (или) контролируют: 1) образование отростков, называемых донорскими половыми ворсинками, которые обязательны (по крайней мере для большинства конъюгативных плазмид) для осуществления донорными клетками контакта с клетками реципиента; 2) вещества, снижающие частоту конъюгации (спаривания) донора с донором, и 3) конъюгационный перенос плазмидной или хромосомной ДНК, начинающийся с определенного места (точка начала переноса) в молекуле конъюгативной плазмиды.
Конъюгативные плазмиды имеют также гены, контролирующие 1) их репликацию, не связанную с половым процессом, 2) число копий плазмид в пересчете на эквивалент хромосомной ДНК н 3) функции несовместимости. В коныогативных плазмидах могут также находиться гены, отвечающие за другие феиотипические признаки, такие, как устойчивость к антибиотикам, устойчивость к ионам тяжелых металлов, продукция бактериоцинов, поверхностных антигенов и энтеротоксинов. Конъюгативные плазмиды имеются, по-видимому, у всех грамотрицательных бактерий; не так давно они были обнару>кены у некоторых видов Б(гер1отусез и Б(гер(ососсиз. Из конъюгативных плазмид лучше всех изучен половой фактор Р (фактор фертильности) бактерии Е. соД К-12. Эта плазмида может существовать как автономно в цитоплазме у Р+-донора, так и в интегрированном состоянии у Н1г-донора.
Реципиентные штаммы не имеют фактора Р и обозначаются Р-, Р~-Доноры передают Р-плазмиды практически всем Р--клеткам, с которыми они спариваются, не генетическую информацию хромо- 1О1 ЧАСТЬ |П. ГРНРТИКА сом они способны передавать лишь с низкой частотой. Все хромосомные маркеры донора Р+ передаются с примерно одинаковой частотой (около 10 ' на одну донорную клетку для любого маркера), и большинство образовавшихся трансконъюгантов наследует фактор Р. Доноры Н1г передают хромосому направленно и последовательно начиная с генетически фиксированной точки, зависящей от места интеграции фактора Р в бактериальной хромосоме.
С самыми высокими частотами переда. ются те генетические маркеры, которые находятся вблизи точки начала переноса Н1г-хромосомы; по мере удаления маркеров от этой точки частота их переноса и наследования пропорционально уменьшается, Такая картина наблюдается вследствие спонтанного случайного прекращения передачи хромосомы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
