Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Бромистый этпдий добавляют после СзС1, так как релаксирующпе белки, которые присутствуют в некоторых плазмидах и образуют одиоцепочечныс разрывы в ДНК, могут актввироваться бромистым этиднем 1201. СзС! в высокой концентрации 17 М) инактивирует релаксационные белки 1201 в плазмидах, благодаря чему можно получнгь больший выход ДНК. 3. Одноцспочечные разрывы плазмидной ДНК даже при высоких концентрациях соли может вызывать видимый свет 1в присутствии бромистого этидия), поэтому все операции должны проводиться в отсутствие прямого освещения.
4. Формирования четких полос и хорошего разделения плазмидной и хромосомной ДНК можно достичь центрифугированнем в течение почи в роторе Весйшап № 65 со скоростью 45 000 об/мин при 15 'С. Разработанные недавно новые модели роторов позволяют разделять плазмндпую и хромосомную ДНК еще быстрее.
чАсть п1. ГвнетикА Определение числа плаэмидиых копий Число копий какой-тибо плазмиды, приходящееся на одну хромосому, представляет собой характеризующий плазмиду параметр, который дает информацию о способе ее репликации. Число плазмидных копий можно установить центрифугированием меченного 'Н-тимином клеточного лизата в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием. Для подсчета числа копий используют приводимое ниже отношение между плазмидным и хромосомным пиками: Радиоактивность (пмп/мнн) плазмидного пика Мйгх Число копийкиЂ Радиоактивность (имп/мнн) хромосомного пика М%гн' где МТ!г, и М%в — молекулярные массы хромосомы и плазмиды соответственно.
Для тиминзависимого штамма в ростовую среду к соответствующему количеству тимина добавляют 'Н-тимин (7 мкКи/мл). Для тиминнезависимого штамма в ростовую среду добавляют 1 мкг/мл тимина, 250 мкг/мл дезоксиаденозина и 7 мкКи/мл 'Н-тимина. Методика включает следующие операции.
1. Выратцивают культуру (1 мл) штамма, содержащего плазмиду, при 37'С в присутствии 7 мкКи/мл 'Н-тимина до плотности, равной 2 10' клетка/мл, 2. Клетки осаждают центрифугированием, промывают их в ТЭ-буфере (0,01 М трис-НС1, 0,001 М ЭДТА, рН 8,1) и ресуспендируют в 400 мкл 0,5 М сахарозы (высокоочищенная, не содержащая рибонуклеазы сахароза в 50 мМ трисе, РН 8,0). 3. К суспензии клеток добавляют 0,2 мл 0,2 М ЭДТА, РН 7,8, н хорошо перемешивают. 4. Добавляют 0,2 мл 1%-ного лизоцнма (в 0,25 М трисе, рН 8,0) и хорошо перемешивают.
Немного встряхивают и ставят в лед на 15 мин. 5. Добавляют к суспензии 1,2 мл 1,2о/о-ного саркозила, после чего немедленно вносят 0,1 мл проназы (! мг/мл) в 0,01 М трисе, 0,02 М ЭДТА, рН 8,1. Проназу следует предварительно проннкубировать 2 ч при 37 'С для самоперсваривания, а затем прогреть перед использованием 2 мин при 80'С. Смесь осторожно пе- !в плхзмг!ды ремешивают и инкубируют при 37'С до тех пор, пока суспензия полностью не просвстлится. 6. Быстро набирают и выдувают обратно раствор ДНК 5-мл пипеткой (для получения фрагментированной хромосомной ДНК), пока раствор не перестанет быть вязким.
7. Центрифугируют 5 мл образца ДНК с радиоактивностью около 500000 имп/мин в цсзий-этидиевом градиенте. В данном случае показатель преломления должен быть на 0,0025 меньше, чем в случае градиента для тритонового лизата. Ценгрифугируют также образец ДНК в линейном градиенте сахаровы (от 5 до 20Ъ). 8. Раскапывают градиенты по дискам фильтровальной бумаги ЪЪа1тап ЗММ.
9. Осаждают радиоактивную ДНК холодной 5е(!-ной ТХУ, содержащей 50 мкг/мл тимина, промывают фильтры 95!)е-ным этанолом и высушивают. Радиоактивность измеряют в сцинтилляционном счетчике, На рис, 15.4 изображен профиль радиоактивности разделенной в цезий-этидиевом градиенте общей клеточной ДНК яз !птамма Е. со(!, содержащего плазмиду. Рекоменда!1ия по определению числа пяазмиднык копий 1.
В одном н том жс градиенте можно выявить как ковалентно замкнутые кольцевые молекулы ДНК (КЗК-ДНК), так и отличные от них плазмидные открытые кольцевые молекулы ДНК (ОК-ДНК). Они разделяются в цезий-этидиевом и сахарозном градиентах. Например, димеры двух КЗК-молекул ДНК мигрируют вместе с мономерами КЗК-ДНК в цезнй-этндиевом градиенте, а в сахарозном градиенте осаждаются порознь. Димеры, состоящие из одной КЗК- и одной ОК- молекулы, в цезий-этидиевом градиенте дают полосу в промежуточном положении между мономерами КЗК- и ОК-молекулами. Димеры двух ОК-молекул ДНК мигрируют в цезий-этидиевом градиенте вместе с мономерами ОК-ДНК, но дают отдельную от них полосу в градиенте сахаровы. 2.
Градиенты сахаровы можно готовить при помощи градиентной смесительной камеры. Другой способ за- 151 ЧАСТЬ 1П. ГЕИЕТИКА ключается в приготовлении раствора сахарозы с концентрацией, средней между крайними концентрациями желаемого градиента с последующим замораживанием его при — 20'С.
Если такой раствор медленно оттаивает в течение ночи при 4 'С, то прн этом получается подходящий для аналитических целей градиент. Например, замороженный раствор 12,5Ъ-ной сахарозы после оттаивания даст градиент приблизительно от 5 до 20$ . 15.3.4. Выявление гомологии (с использованием эндонуклеазы, специфически расщепляющей одноцепочечную ДНК) Основой для любого изучения гомологпи является диссоциация двухцепочечной плазмидной ДНК и последующий специфический отжиг одноцепочечной ДНК из гомологичного пли гетерологнчиого источника (реассоциация ДНК).
Плазмидные гомо- и гетеродуплексы анализируют с помощью специфичной по отношению к одноцепочечной ДНК эндонуклеазы 51 пз Аэреге!1!из огугае. Приводимая ниже методика [5) позволяет точно и быстро определять, насколько гомологнчны или гетеро- логичны полинуклеотидные последовательности. Это особенно полезно для проведения экспресс-анализов и для других исследований, в которых требуется постановка большого числа проб на гибридизацию ДНК вЂ” ДНК, В качестве стандарта используют очищенную радиоактивно меченную ДНК, которую гнбридизуют с очищенной суммарной клеточной ДНК из штаммов, содержащих плазмиды. ДНК какого-либо штамма, не содержащего плазмиды, служит контролем.
Для проведения реакций реассоциацин ДНК вЂ” ДНК, оцениваемых методом с применением эндонуклеазы 51, фрагментированную денатурированную очищенную плазмндную ДНК с радиоактивностью 5000 — !0000 имп/мин (обычно это меньше 0,00! мкг ДНК) инкубируют со 150 мкг нефракционированной суммарной фрагментированной денатурированной бактериальной ДНК из штаммов, содержа!цих и не содержащих плазмиды, в 0,42 М 5)аС! в общем объеме 1 мл. Такие смеси инкубируют при температуре, которая зависит от суммарного процентного содержания гуанина и цитозина (6+С) в плазмидной ДНК, В слу- 1О. ПЛАЗМИДЫ чае гомологни реассоцнацня осуществляется фактически полностью. Время, необходимое для полной реассоциации плазмидной ДНК, представляет собой функцию ее молекулярной массы и концентрации ионов. Время реассоциации определяют, вычисляя значение Со! Аи где Со — начальная концентрация ДНК, 1 1х — время достижения 50о1о-ной реассоциацпи ДНК (при концентрации С,) для данной температуры, концентрации соли и размера фрагментов ДНК.
Эмпирическая формула 17] имеет вид Молекулярная масса плазмндной ДНК о аи 3 1О' Время инкубации, требуемое для получения полной реассоциации в присутствии 0,42 М НаС!, равно приблизительно 8 Со(по, Таким образом, 8Соуцо Согх где Со — начальная концентрация плазмидной ДНК (которую можно вычислить нли оценить, исходя из числа копий плазмпды), а 1, — время реассоциацип. В оптимальных условиях прп инкубации только одной меченой плазмидной ДНК реассоциация цепей этой ДНК друг с другом (самореассоциация) должна составлять менее 10%, в то время как в присутствии гомологичной ей немеченой ДНК реассоциировать должно более 85о1о. В каждом эксперименте измеряют также реассоциацию меченой плазмидной ДНК с ДНК не несущих плазмид бактериальных клеток и вычитают величину этой реассоциации (около 10о/о или меньше) из величик реассоциации, определенных для каждой реакции.
Гибридизация 1. Смесь для реассоциации: 150 мкг немеченой, обработанной ультразвуком суммарной клеточной ДНК; меченая обработанная ультразвуком плазмндная ДНК с радиоактивностью 5000 †100 имп(мнн; ХаС! в количестве, достаточном для создания концентрации 0,42 М в общем объеме 1,0 мл, 2. ДНК денатурируют кипячением в этой смеси в течение 10 мин и затем раствор ДНК помещают в лед, 133 чАсть нь ГенетикА 3, Ннкубируют смесь для реассоциацпп при температуре 55 — 70'С, зависящей от процентного содержания О+С в плазмпдпой ДНК. Плазмндную ДНК, меченную 'Н-тимином, выделяют в виде КЗК-ДНК методом, в котором для лизиса клеток используется тритон (равд. 15.1.2).
Можно также ДНК пометить !и гйго. Удельная активность меченной 'Н-тимином ДНК, получаемой этим методом, обычно составляет -10' имп/мин/мкг, Эту плазмпдную ДНК подвергают обработке ультразвуком, чтобы получить фрагменты с мол. массой -2,5 1О'. Суммарную клеточную ДНК готовят, как описано в гл. 15. Эту ДНК также фрагментируют с помощью ультразвука до величин мол, массы -2,5 10'. Реакция с эндонуклеазой 5/ Эндонуклеаза 51 с очень хорошей активностью имеется в продаже (8!цта, номер по каталогу 5255). 1. Готовят исходную реакционную смесь (назовем ее 81-реакционной смесью): 0,125 мМ УИВОИ 87,5 мМ ЫаС!, 37,5 ИМ На-ацетатный буфер, рН 4,5, 25 мкг/мл ДНК (пз тимуса теленка) — и хранят ее замороженной при — 20'С в аликвотах по 0,8 мл, В реакционную смесь при проведении эксперимента входит 0,8 мл 51-реакционной смеси и 0,2 мл смеси для реассоциаци~.
Конечные концентрации веществ в пробе составляют: 0,1 мМ 2п50,, 150 мМ 5/аС! (с учетом )ЧаС1, внесенного с 0,2 мл смеси для реассоциации), 30 мМ )ча-ацетатный буфер, рН 4,5, и 20 мкг/мл ДНК из тпмуса теленка. Для каждой реакции реассоциацпи ставят две пробы с обработкой эндонуклеазой 8! и две пробы без обработки ферментом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
