Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 28
Текст из файла (страница 28)
массой 5,5.10з, На рис, 15.2 показаны картины разделения фрагментов нлазмидной ДНК, полученных после обработки рсстриктазой Н1пс П. Во всех пробах была обнаружена сходная плазмндная ЛНК с мол. массой 5,5 1Оз. Такой результат свидетельствует о том, что изу гаемые плазмнды гомологичны. 143 ЧАСТЬ ИЬ ГЕНЕТИКА Для расщепления плазмидной ДНК рестриктазой Нтс П использовали следующую методику. 1. Обрабатывали 20 мкл очищенной плазмидной ДНК ( 0,2 мкг ДНК) в буфере (10 мМ трис-НС1, 50 мМ ЫаС1, 6 мМ 2-меркаптоэтанол, 6 мМ МпС1т, рН 7,0) рестриктазой Оис П (скетч Епп!апб В!о!аЬЕ; 2000 ед. акт./мл), которую добавляли в количестве 2 ед.
акт. 2. Реакционную смесь инкубировали 90 мин при 37 'С. 3. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл водного раствора 0,07%-ного бромфенолового синего, 7%-ного ДСН и 33%-ного глицерина. 4. Проводили электрофорез всей реакционной смеси в 0,7%-ном агарозном геле, как описано в равд. 15.3.1. 5. Сравнивали картины полос фрагментов после окрашивания бромнгтым этидием (равд. 15.3.1). В некоторых случаях крайне желательно экстрагировать разделенные в агарозном геле фрагменты.
Они могут понадобиться для исследования химическими и физическими методами, а также для установления деталей структуры рестрикционным анализом, определения последовательности оснований в ДНК, гетеродуплексного анализа и гибридизации с использованием эндоиуклеазы !61 или блоттинга методом Саузерпа (28!. Приводимая ниже методика (11) позволяет экстрагировать с хорошим выходом всевозможные интактные, биологически активные молекулы ДНК непосредственно из полос, которые они образуют в агарозном геле.
Для осуществления этой операции нужен выпускаемый промышленностью препарат агаразы (Са1Ь(осЬет, 1 а бо11а, СаИ., номер по каталогу 121811) — фермента, расщепляю- щего агарозу. 1. Гидролиз эндонуклеазой и электрофорез в атарове с окраской бромистым зтндием (равд. 15.3.1) описаны выше. Фрагменты ДНК, разделенные в 0,6%-ном агарозном геле (трубочка диаметром 0,6 см и длиной 1! см), выявляют в ультрафиолете, а диски геля с этими фрагментами вырезают бритвенным лезвием. Можно одновременно обрабатывать несколько вырезанных дисков (по 0,05 — 0,1 г каждый) с одним н тем жс фрагментом.
141 пс пллзмнды 2. Разрушают диск геля в 0,1 М трисе, рН 5,95 (О,! мл на диск). Суспензию гомогенизируют, набирая н выпуская ее трижды пластмассовым шприцем (без иглы) объемом 1 мл в центрифужный стакан из пирекса. 3. Добавляют раствор агаразы (50 мкг на диск) в О,! М тряс-НС1, рН 5,95 (концентрация фермента 1 мг)мл), и инкубируют 2 ч при 37'С. 4. Удаляют агарозу центрифугированием при 48000 д в течение 30 мин при 4'С. 5. При необходимости надосадочную жидкость, содержащую ДНК, можно сконцентрировать осаждением двумя объемами этанола илн диалнзом против полиэтиленглпколя.
6. Перед концентрированием проводят дополнительную очистку препарата пропусканием надосадочной жидкости через фильтр Бвчппех (М!1!!роге Согр., Веб1огд, Маза.) с размером пор 0,45 мкм. Прн получении ДНК этим методом выход составляет -75 — 80а(а для плазмидной ДНК с мол. массой 7,4. !О' — 60 1О' и для фрагментов, полученных под действием рестриктазы Есо К! с размерами от 0,75.10' до 13,9 10'.
ДНК, экстрагируемая с помощью агаразы, вызывает трансформацию фактически с той же частотой (для клеток Е. соД), что и ДНК, не контактировавшая с этим ферментом. Извлеченные из гелей фрагменты ДНК с успехом использовались в экспериментах по клонированию в качестве источника или носителя генетической информации [! 1). 15.3.3. Центрифугироваиие в градиенте плотности (с использованием бромистого этидия) Молекулы плазмидной ДНК, полученные из клеток бактерий, представляют собой двухцепочсчные ковалентно замкнутые кольцевые структуры, не имеющие свободного конца, вокруг которого онп мотли бы раскручиваться. Бромнстый этидий, относящийся к ряду фенатридиновых красителей, связывается с ДНК и РНК н тормозит функционирование нуклеиновых кислот [5, !51.
Клетки лизируют н лизаты наносят на градиенты хлористого цезия, содержащие бромнстый этидий. При высокоскоростном центрифугировании ДНК седименти- ЧАСТЬ 1П. ГЕНЕТИКА рис. 15.3. Результат цеитрнфугнрова. пяя бактериальиого литата, полученного при добавлении тритона Х-Г00, в цезий-этндневом градиенте. !1ри освещении ближним ультрафиолетовым светом видны дае полосы люминесценции и1перкалировавщего в ДВК бромнстого этидия. Верхняя по.
лога соответствует хромосомной ДГГК, нижняя —. плазмндной ДВК, Таблица 15.2. Компоненты смеси, добавляемые при центрифугировании в цезий-этидиевом градиенте плотности Твп 1сото1м Состав пробы 60 Тьбб ГГизат 3,2 мл 24 мл ТЭН-буфер 2,0 мл 3 мл С6С! 4,9 г 23 г Бромистый этнднй 0,2 мл 1 мл рует до установления равновесия. Встраиваясь в молекулу ДНК, бромистый этидий уменьшает ес плотпостс, 13, 25).
Линейная молекула ДНК или разомкнутая кольцевая (с разрывом в одной цепи) молекула плазмидной ДНК не имеет тех физических ограничений, которые характерны для ковалентно замкнутой кольцевой (КЗК) плазмидной ДНК. Вследствие этого первые ДНК связывают значительно больше молекул бромистого этпдия и их плотность становится меныпе, чем плотность КЗК-ДНК. Эта разница в связывании красителя позволяет разделять разные формы плазмидной ДНК, В градиентах хлористого цезия формы с встроенным 140 !3. плхзмидь! бромистым зтидием благодаря люминесценции последнего могут быть визуально зафиксированы в ультрафиолетовом свете в виде дискретных полос (рис, 15.3).
Для осуществления методики, приведенной ниже, требуются препаративная ультрацентрифуга, переносной источник ультрафиолетового света (В!аск Кау, (ЛЧ.-22; Цйгач!о)е1 Ргобцс(з, 1пс., 5ап ОаЬг!е!, Са)!1.), градиентатор и рефрактометр (АЬЬ)е 3Ц ВацзсЬ апг( (.ошЬ, 1пс., КосЬез1ег, Ь)У). Материал, выделенный с помощью тритона Х-100 (равд. 15.1.2), можно, к примеру, обработать следующим образом. 1. В полиалломерный центрифужный стакан размером 1,6Х7,6 см центрифуги Вескщап вносят 5 г хлористого цезия, 2 мл буфера ТЭН и 3,2 мл клеточного лизата.
2. Перемешивают содержимое стакана до полного растворения хлористого цезия и добавляют 0,2 мл раствора бромистого этпдия (10 мг/мл в ТЭН-буфере). 3. Измеряя показатель преломления раствора, доводят его плотность до 1,3925~0,001 г/см добавлением ТЭН-буфера или сухого хлористого цезия, Показатель преломления измеряется с ошибкой и может быть разным при измерении разными приборами, поэтому рекомендуется в пробных экспериментах стандартизировать измерения.
При необходимости в стаканы доливают минеральное масло. 4. Подготавливают стаканы к ультрацентрифугированию, согласно предписанию фирмы-изготовителя, и ставят их в соответствующий ротор. Стаканы должны быть хорошо уравновешены. В соответствии с объемом лизата можно использовать полиалломерные стаканы любого размера. Например, при крупномасштабном выделении с использованием тритона получают 20 мл лизата, которые можно центрифугировать в полиалломерном стакане для ротора Вескгпап Т1-60. А если объем лнзата около 10 мл, то можно провести центрифугированис в полиачломерном стакане для 65-го ротора (Вескгпап).
В табл. 15.2 указаны различныс соотношения буфера ТЭН, хлористого цезия и бромистого зтидия. 5. Центрифугирование проводят со скоростью 40000 об/мин при 15'С в течение по крайней мере 44 ч 147 ЧАСТЬ П!. ГЕНЕТИКА О рамоеома 200 9 700 --- 20 70 О 70 20 30 40 30 60 77амер щпагиии Рис. !3.4.
Определение числа копий плазмид. Бактериальный штамм, содержащий плазмиды, был выращен иа миннмалыюй солевой среде с добавкой казамнновых кислот и глюкозы. После введения метки п ливиса полученный лизат был отпентрвфугирован в цезий-зтидиевом градиенте, как описано в раза.
13.3.3. Фракции (по семь капель каж. дая) собирали в емкости для микротитрования и азмеряли в них радиоактивность. в препаративной ультрацентрифуге Вес)стап (или какой-либо аналогичной ей). После центрифугироаания просматривают стаканы с градиентами в ультрафиолете в поисках полос, люминесцирующих благодаря образованию комплексов ДНК с бромистым этндием. Отбирают плазмидную ДНК (нижняя полоса в градиенте на рис. 15.3) через дно стакана, пользуясь каким-либо прибором для фракционирования градиентов.
6. Когда в опыт берут радиоактивный препарат ДНК, фракции проверяют на радиоактивность, Типичный профиль распределения радиоактивности, показанный на рис. 15.4, свидетельствует о четком разграничении фракций плазмидной ДНК с болыпей плотностью и хромосомной ДНК с меньшей плотностью. 7. Освобождают ДНК от бромнстого зтидия, зкстрагнрчя препарат не менее четырех раз изопропанолом, насыщенным хлористым цезием.
148 и плхзмиды 8. Диализуют препарат ДНК против соответствующего буфера, чгобы удалить хлорпстый цезий, 9. Разделяют очищенную плазмидпую ДНК на несколько порций и хранят прн — 20'С, Метод лнзирования клеток с последующим центрифугированием в градиенте плотности можно использовать для выяснения вопроса о том, содержит ли данный бактернальный штамм плазмндную ДНК, Правда, данный метод требует дорогостоящего оборудования и больших затрат времени, к тому же с его помощью можно проверить одновременно лишь относительно небольшое число культур.
Однако это лучший метод очистки плазмидных ДНК в количествах, достаточных для дальнейшего анализа, Некоторые рекомендации по поводу центрифугирования в градиенте плотности. 1. Чтобы полностью устранить загрязнение хромосомной ДНК (верхняя полоса в градиенте, рис. 15.3), проводят вторичное центрифугироваиие собранной плазмидной ДНК в градиенте хлористого цезия с бромнстым этиднем. Собирают плазмидную ДНК, вновь образовавшую полосу, с помощью раскапывания градиента со дна стакана или шприцем, проколов иглой стенку стакана. 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
