Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Если имеется избыток глюкозооксидазы и недостаток глюкозы, потенциометрическая реакция дает возможность определить содержа- 186 и Физические методы пие глюкозы в пробе. Ппи избытке глюкозы и недостатке глюкозооксидазы скорость изменения потенциала можно использовать для измерения количества фермента, Посколы<у нет никакой системы для абсолютной калибровки проб (искл<очение составляет водородный электрод для измерения рН), с этой целью обычно используюг разбавления стандартных маточных растворов, приго<овленных из полностью диссоциирующих солей [161.
Что касается чувствительности измерений, то нх можно проводигь в диапазоне от !О-' — 10-' М до 1 М для выбранного иона. Датчик редко бывает высокоспецифическим в отношении какого-то одного иона. В действительности па результаты измерений часто влияют другие попы. Например, 10~/» ответной реакции, которую дает кальциевый электрод, приходится на эквивалентные количества РЬ'+, Хп»+, Сц'" и Ре»ь, присутствующих в концентрации 10 з — 1Π— ' М. Хлоридные электроды реагируют таким же образом на иоднд- и бромид-ионы, т. е. при их концентрации 10 — ' — 10-' М они дают 10<7» всего отклика электрода. С другой стороны, К"-электрод совершенно нечувствителен к На+, 1.1+, Сз+ ч Н+.
Степень чувствительности и избирательности измерений зависит от конкретного электрода. За подробной информацией по этому вопросу следует обращаться к инструкциям фирм-изготовителей. 16.2.3. Полярографическнй метод определения кислорода [121 Взаимодействие кислорода с платиновым электродом при потенциале от — 0,5 до — 0,8 В описывается уравнением О» + 2Н»О + 4« = 40Н . Это уравнение показывает, что данный процесс сопровождается образованием потока электронов, т.
е. возникновением тока в направлении к электроду. Ток, проходящий через резистор, на выходе из него создает напряжение. «Потенциал» такого полуэлемента при использовании его в сочетании со стандартным Нд»С!мпо- 187 ЧАСТЬ Нх МЕТАБОЛИЗМ луэлементом или с хлорсеребряным электродом можно измерить, если эти два полузлемента соединить солевым мостиком.
Кроме того, силу тока можно определить с помощью гальванометра. Измерение напряжения проводят после его усиления. Обе эти процедуры не требуют применения электрода сравнения. Платиновый электрод может быть стационарным, вращаюгцимся или вибрирующим (для сведения к минимуму диффузионных градиентов). Однако такие электроды обычно легко загрязняются при их применении для анализа биологических образцов.
Эта проблема не возникает при использовании кислородного электрода Кларка 113], представляющего собой платиновый электрод, покрытый газопроницаемой мембраной. С помощью платинового электрода измеряют число, присутствующих на его поверхности молекул кислорода, главным образом на основе теории соударений. В электроде же Кларка время ответа пропорционально скорости диффузии кислорода через мембрану. В такой системе трансмембранный градиент концентрации кислорода возникает нз-за того, что на поверхности электрода концентрация кислорода вследствие его потребления равна нулю.
К счастью, скорость диффузии кислорода линейно зависит от его концентрации или парциального давления. Выход тока зависит также от площади платинового катода. Кривая зависимости силы тока от поляризующего напряжения в диапазоне от — 0,5 до — 0,8 В изменяется пропорционально или почти пропорционально концентрации кислорода. Поэтому поляризующее напряжение должно соответствовать середине этого участка кривой. Подобная зависимость силы тока от поляризующего напряжения является главной характеристикой кислородного электрода. Влияние температуры Ток датчика весьма чувствителен к температуре, так как проницаемость материала мембраны имеет высокий температурный коэффициент (около 3 — 5% на 1'С).
Кроме того, как хорошо известно, растворимость кислорода также зависит от температуры. Поэтому при рабо- 1е Физические методы те с кислородным электродом необходим строгий контроль температуры и тщательное уравновешивание измеряемых рагеворов прн заданной температуре. Калибровка и расчеты Калибровка прибора основана на том, что кислород обладает определенной растворимостью в данных условиях, Для измерения нулевой концентрации кислорода к контрольному раствору добавляют дитионит натрия.
Чтобы установить шкалу прибора на 100% ,используют какой-либо раствор, насыщенный кислородом. Концентрацию кислорода рассчптывают по коэффициенту распределения Бунзена, который можно найти в справочниках «1п!егпа!юпа! Сг!1!Са! ТаЫез» или «Напг(Ьоо(с о1 СЬегпийгу апо РЬуз!Сз». Затем определяют содержание кислорода в растворах, используемых в качестве рабочих стандартов.
В большинстве случаев не требуются данные об истинной концентрации кислорода в стандартных растворах; для установки прибора необходимо лишь, чтобы показания концентрации кислорода были воспроизводимыми, так как измерения должны выявить разницу между экспериментальными образцами. Например, если насьпценный воздухом раствор Рингера содержит б мкл Ое/мл, то 3 мл раствора, имеющего, согласно показаниям прибора, 92% насыщения, содержат 13,8 мкл Ое (ЗХ5,0Х0,92). Скорость потребления или выделения кислорода либо подсчитывают исходя из двух измерений, проведенных в разное время, либо определяют по наклону кривых, построенных на основе многократных измерений и отражающих зависимость сигнала (в процентах полной шкалы) от времени.
Так, если прибор показывает 92 и 70% при 0 и 5 мин соответственно, то расчеты производят следующим образом: 92 — 70 = 22% потребленного О, зл 5 мии, 5,0 3 =- 15 мкл О 0,22 = 3,3 мкл/5 мии (екоросп реакции). К сожалению, не бывает так, чтобы изучаемые реакционные смеси имели тот же состав, что и проба, принятая при измерении за стандартную, поэтому в расчетах неизбежна некоторая ошибка.
Однако эту ошибку можно свести до минимума, поддерживая низкую об- 189 чдстыч метдволизм щую концентрацию растворенных веществ. Если необходимы растворы с более высокой концентрацией кислорода, можно создать повышенное парцнальное давление путем насыщения стандартных и рабочих растворов кислородом или кислородно-азотной смесью.
На содержание кислорода в стандартных растворах и реактивах влияют температура и атмосферное давление. Колебания барометрического давленния редко изменяют концентрацию кислорода более чем на +3% . Барометрическая поправка к коэффициенту Бунзена рассчитывается следующим образом: Наблюдаемое барометрическое давление ° Расгварнмость нрн 760 мм Не 1ю101,3 кПа), Проведение полярографических измерений с помощью кислородного электрода В начале эксперимента датчик следует проверить по четырем показателям: 1) наличию плато на кривой зависимости силы тока от поляризующего напряжения, 2) времени ответной реакции на ступенчатое изменение поляризующего напряжения 3) шуму и 4) дрейфу нулевой линии.
Отсутствие горизонтального плато свидетельствует о загрязненности электрода, однако во многих случаях некоторый наклон данного участка кривой вполне допустим. Время ответной реакции на ступенчатое изменение поляризующего напряжения должно быть равно 1 — 1,5 мин. Шум может возникать вследствие плохих соединений и заземления, повреждения мембраны (образование складок, отверстий, кристаллов КС1 нлн высыхание) или из-за неплотного контакта кислородного электрода с серебряным электродом; в последнем случае рекомендуется промывание системы аммиаком.
Дрейф нулевой линии правильно работающего датчика должен сосаавлять менее 2% в час. Дрейф может быть вызван атмосферными изменениями или загрязнением датчика органическим материалом. Следовательно, правильный уход за датчиком и его чистота имеют важное значение. В одной из работ сообщалось о получении !а Физические методы воспроизводимых результатов при промывании датчика и резервуара реактивами, использовавшимися при анализе. Сборка мембраны электрода Важное значение при работе с электродом Кларка имеет прикрепление мембраны.
Фирмы-изготовители вместе с прибором поставляют инструкции по его эксплуатации и запасные мембраны. При сборке мембраны следует обратить внимание на то, чтобы она ровно облегала датчик, чтобы везде создавалась полная герметизация и чтобы на мембране со стороны электрода не было пузырьков воздуха. Для хорошего смачивания системы одна из фирм рекомендует добавлять 3 — 4 капли жидкости «Коба)г Рйо1ойоч > на флакон раствора КС1, используемого в этом электроде. 16.3. ХРОМЛТОГРЛФИЯ В хроматографии и родственных методах разделения используются различные процессы распределения веществ между двумя фазами, многократно повторяющиеся в элементарных пространствах 117, 21, 231. Поэтому такие виды хроматографии, как ионообменная, распределительная, адсорбционная, аффинная н гель- проникающая, основанные на различиях в самых разных свойствах разделяемых веществ, можно проводить с помощью однотипного лабораторного оборудования.
16.3.1. Ионообменная хроматография В этом виде хроматографии сорбция растворенных веществ основана на наличии у них ионного заряда, хотя на разделение могут оказывать некоторое влияние и другие типы связывания. Заряженные группы в проницаемой для подвижной фазы матрице (остове) могут обмениваться с ионами из раствора: — (Х) — 50з Ь(а + К+С! — — (Х) — $0з К + Ь)а~С1-. Матрица может быть изготовлена из поперечно-связанных замешенных смол, таких, как полистирол или по- 191 ЧАСТЬ ИА МВТЛВОЛПЗМ лиметилметакрилат, а также из модифицированных углеводсодержащих природных полимеров, например из целлюлозы, декстрана или агарозы. Существует огромное разнообразие понообмсннпков, различающихся по функциональным группам, материалу носителя, «чистоте», пористости, хроматографической емкости, размерам частиц, форме, селективности н прочности.
Поэтому для получения специальной информации следует обращаться к технической литературе, которую выпускают фирмы, производящие смолы, например фирмы Ооч Сйет(са! Со. (смолы дауэкс), гтоЬт апб Нааз Со. (амберлайты)„В!о-Кад 1.аЬога1ог1еь, поставляющие большое число различных ионообменников, РЬагтас!а Г!пе СЬегшса1з (сефадексы), Веете Апце! Со. и ЮЬа1- тап Со. (целлюлозные ионообменники).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
