Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 38
Текст из файла (страница 38)
муравьиной кислотой. После введения пробы через колонку пропускают по 10 мл воды, 2 М муравьиной кислоты и 4 М муравьиной кислоты, а затем по 10 мл 8 М муравьиной кислоты, содержащей 20 ММ, 100 мМ и 1 М формиат натрия [421. Промежуточные продукты цикла трикарбоновь!х кислот [44) 0,5 мл экстракта, доведенного до рН 6, вводят в колонку размером 0,9Х14 см с ЛС1-Х10 в формиатной форме. Для элюирования необходимо 150 мл градиента, создаваемого при добавлении 3 М муравьиной кислоты в закрытый смеситель на 250 мл, наполненный водой.
Затем через колонку пропускают 2 н. формиат аммония со скоростью 2 мл/мин. р-Гидроксибутират, ацетоацетат, сукцинат, малат, пируват, цитрат (изоцитрат), а-кетоглутарат и фумарат элюируются в перечисленном порядке в виде отдельных пиков. Ионообменники на основе целл!аловы, декстрана и агарозы [461 При разделении макромолекул используют модифицированные природные полимеры, которые по ионообменной емкости и другим свойствам обы шо более пригодны для этой цели, чем искусственные смолы.
В случае декстрана и агарозы можно контролировать степень их попере шаго связывания и размеры частиц, регулируя тем самым сжатие и набухание ионообменников и обеспечивая их высокую емкость для макромолекул при высоких и средних скоростях потока. Поскольку белки амфотерны и имеют большое число зарядов, часто сгруппированных в виде скоплений, с ними можно обращаться как с катионами или анионами, выбрав значение рН для их ионообменного разделения на одну или несколько единиц выше или ниже изопонной точки или величины р1. В повторяющихся !в Физические методы Таблица ! 6.З.
Производные целлголозы и декстрана, используемые в понообмепной хроматографии Провзволвоа Оеознаааааа Сильная кислота 55,6 4 т 9 Сульфопроппл СП Фосфоцеллюлоза Карбокснметпл Смешанный амин Бензоплпрованный дпэтплампноэтпл Днэтплампноэтпл Трнэтплампноэтпл Днэтпл-2-окснпропнламнноэтггл ф Кйт Эктеола БД ДЭАЭ ТЭЛЭ ДЭОПЛЭ 9,5 9,5 Сальное осно- ванпе Практические замечания Успешное использование ионообменников основано на разумном выборе ряда параметров, таких, как тип обмена, состав буфера, рабочее значение рН, ионная си- 199 циклах связывания и элюирования используется изменение рН, приводящее к исчезновению ионных групп, т.
е. карбоксильных или аминогрупп на молекулах белка или частицах ионообмснника. Элюирование можно осуществлять также путем замещения одного иона другим. Диэтиламиноэтилпроизводное целлюлозы, декстрапа или агарозы представляет собой слабый анионообменник (рК-9,5; табл.
15.3). Поэтому в нейтральной среде аминогруппа протонируется и связывает белки и пептиды, если рН среды приблизительно соответствует илп превышает величины их р1. Карбоксиметилпроизводные тех жс носителей представляют собой катионообменники с рК около 3,5. Разделение обычно проводят при рН выше 4. Сопбция происходит эффективно, если рН разделения ниже изоэлектрнческой точки белка и выше 4.
Эктеола-целлюлоза и такое же производное декстрана имеют рК 7,5, Этот ионообменник хорошо зарекомендовал себя при хроматографии нуклеиновых кислот н нуклеопротеидов. часть и мктльолизм ла, вид матрицы, размер ее частиц, форма и пористость, а также размеры колопки и программа элюиронания. Кроме того, необходимо обратить внимание на набивку колонки, введение пробы, поддержание низкой вязкости исследуемого раствора и конструкцию колонки, поскольку эти факторы также определяют степень разрешения. Обсуждение этих аспектов во всех деталях выходит за рамки данной главы, поэтому здесь будут рассмотрепь1 только общие рекомендации по каждому пз перечисленных факторов.
Подробную информацию по всем этим вопросам можно найти в работе Блэттнера и Эриксона 133), а также в брошюрах, издаваемых фирмами Ъ'11а1- гпап, 1пс. (ионообменные целлюлозы) и Рпаггпас(а, 1пс. (сефадексы). Сферические декстрановые гранулы одинаковых размеров и формы (сефадекс) обеспечивают обычно более высокие скорости потока, хотя выпускаемые сейчас производные целлюлозы также дают хорошие результаты в этом отношении. При использовании шариков или частиц меньших размеров скорость потока снижается и разделение соответственно улучшается.
Повышение пористости частиц приводит к увеличению емкости ионо. обмепиика для данной молекулы, что особенно важно при работе с макромолекулами. Выбор иоиообмен~ика зависит от того, в каких ионных формах находятся вещества, которые предстоит разделять.
Выбранное значение рН должно по меньшей мере на одну единицу отличаться от изоэлектрической точки или значения рК для диссоциируемой группы. При работе с аниоиообмеиниками по возможности следует применять катионные буферы [алкиламины, аммиак, веронал, вмидазол и трио(гидроксиметил)аминометаи (тряс)), а при использовании катионообменников — анионные буферы (ацетат, веропал, цитрат, глицин и фосфат). Для диэтиламииоэтилсефадекса рекомендуются значения рН от 2 до 9, а для карбоксиметилсефадекса — от б до 10. Ионная сила влияет иа связывание иолов и, следовательно, па емкость ионообменника.
Рекомендуется применять буферы с относительно высокой ионной силой (около 0,1 М), одпако их концентрация должна быть несколько ниже, чем та, которая необходима для элюирования нужных ионов. 200 !к Физические мЕтОДЫ Разрешающая способность колонки определяется ее высотой. Если зона поглощенных ионов имеет ширину ! — 2 см, то для начала рекомендЗется использовать слой сорбента высотой 20 см. Прн заданной высоте слоя емкость колонки линейно зависит от площади ее поперечного сечения. Элюирование осуществляют, либо изменяя рН, что приводит к уменьшению или устранению ионного заряда, либо путем повышения ионной силы до такой величины, при которой ион буфера вытесняет интересующий нас ион.
Элюцию проводят с помощью ступенчатого или постепенного изменения указанных параметров. В случае анионообменннков снижают рН или повышают ионную силу, при использовании же катионообменников элюпрование осуществляют путем повышения рН или ионной силы. Вначале необходимо определить либо общее содержание ионов в пробе, либо размеры колонки, так как емкость — это свойство, зависящее от объема ионообменника конкретного типа. Ионный состав пробы должен быть таким же, как и ионный состав исходного буфера.
При необходимости ионный состав пробы изменяют на желаемый с помощью гель-фильтрации на сефадексе 6-25, диализа или разбавления. Объем пробы не имеет большого значения при всех программах элюирования, кроме того случая, когда в качестве элюента используют только исходный буфер. Пробу следует вводить так, чтобы она не смешивалась с поступающим в колонку элюирующим буфером и чтобы слой сорбента ппи этом не нарушался. Как и в других видах хроматографии, в данном случае также имеет большое значение использование специально сконструированных стеклянных колонок, которые удобны для набивки, введения в них элюента и пробы, выдерживают высокое давление (когда оно необходимо), позволяют регулировать скорость потока и предотвращать высыхание сорбента, а также имеют минимальный объем над слоем ионообменника и под ним.
Кроме того, необходимо установить критерии, по которым можно судить о достижснии поставленной цели, и определить эффективность колонки, анализируя эффлюент (элюат). ЧАСТЫН МЕТАБОЛИЗМ 16.3.2. Адсорбционная хроматография Адсорбция — это процесс, обусловленный вандерваальсовыми силами, электростатическим и гидрофобным взаимодействиями, а также стерическими факторами. Адсорбция индивидуального вещества описывается типичной изотермой адсорбции Ленгмюра, которая представляет собой гиперболу на графике зависимости концентрации растворенного вещества от количества адсорбированного вещества.
Такой же кривой описывается и насыщение фермента субстратом, а также «закон убывающего плодородия». Поверхностную сорбцию и элюцию неполярных веществ успешно осуществляют с помощью силикагеля, кизельгура, окиси алюминия, флорнсила и активированного угля. Полярные макромолекулы, такие, как белки и нуклеиновые кислоты, очищают либо методом статической сорбции, либо в условиях колоночной хроматографии с использованием гидроксиапатита, кальций-фосфатного геля или С» -модификации окиси алюминия.
Типы адсорбенгов ААля о истин про тых с ожны липидов, ж рных кислот, стеролов, фенолов и углеводородов используют кремневую кислоту. Элюирование осуществляют путем изменения состава растворителя (обычно от среднеполярного к полярному). Разделение стероидов, алкалоидов, углеводородов, сложных эфиров, органических кислот и оснований, а также других органических веществ проводят на нейтральной окиси алюминия (рН 6,9 — 7,1) в безводных растворителях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
