Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 42
Текст из файла (страница 42)
Когда же белки вступают в реакцию, то вполне вероятно, что они образуют несколько ковалентных связей с матрицей. К сефарозе, активированной бромцианом, можно присоединить удлиняю1цне «мостики», которые могут иметь па копнах амнпогруппы, карбоксильные, тиоловыс н другпе функциональные группы. Замешенную агарозную матрицу можно получить в лаборатории [36! или можно купить готовую агарозу с присоединенным к ней в качестве удлиняющего «мостика» алкиламином, конец которого связан с сукцинил-Ь(-сукцинимидным эфиром.
Эта группа реагирует с алкил- или ариламинами. 217 чАсть!ч мятхволизм В случае сефарозы, активированной бромцианом, удлиняющие «мостики» чаще всего получают с помощью реакции с 1,6-диаминогексаном и 6-аминогексановой кислотой. Для присоединения лнганда используют водо- растворимый карбодиимид, в результате чего образуются амидные связи.
В этой реакции гндрохлорид 1-этил- 3-(3-диметиламинопропил)карбоднимида или 1-циклогексил - 3-(2-морфолиноэтил) карбодиимидм сто-и-толуолсульфонат дают хорошие выходы в водных и не водных средах при рН 4,5 — 6,0. Использование сефарозы, активированнои бромцианом Активированную сефарозу можно купить в виде лиофилнзированного порошка (1 г соответствует примерно 3,5 мл набухшего геля) или приготовить по методу Аксена и др. 132). Сухой порошок промывают несколько раз на фильтре из пористого стекла (О-З), используя для промывания по 200 мл 0,1 М НС1.
Промывную жидкость удаляют, отсасывая ее с помощью насоса. Промытый и набухший гель применяют сразу же после приготовления. Методика связывания лиганда или удлиняюи1его «мостика» с матрицей Белок или лиганд, содержащий аминогруппы, растворяют в )чаНСОз (0,1 М, рН 8,3) с добавленным к нему 0,5 М МаС! (только для белков). Берут 5 — 10 мг белка на 1 мл геля. Следует помнить, что нельзя использовать буферы, содержащие амины. Гель я лиганд медленно перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4'С (магнитную мешалку при этом нельзя применять). Избыточный белок отмывают исходным буфером, а избыток связывающих групп удаляют, обрабатывая реакционную смесь 1 М этаноламином (рН 9,0) в течение 2 ч. Можно использовать и другие амины, в том числе трис-буфер.
Конечный продукт промывают 4 — 5 раз буферными растворами с высоким и низким рЫ, например 0,1 М ацетатом (рН 4,0) и 0,1 М боратом (рН 9,0), содержащим 21В М ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 1 М ХаС!. Смена рН обычно необходима для удаления адсорбироваппого белка. Суспеизии хранят в холодильнике (ие замораживая) и добавляют к иим бактериостатическпе вещества, если предполагается длительное хранение. Конечно, описанную методику следует модифицировать, если требуется стабилизировать данный белок.
Необходимо отметить, что при низких рН СХВгсефароза стабильна (и ие очень реакциоииоспособиа), а при высоких рН становится реакциоиноспособиой. Амииогексил- или 6-амииогексаиоатсефарозу связывают с лигаидом карбодиимидиым методом. Высушеииый материал взвсшивают и погружают для иабухаиия в раствор 0,5 М ЫаС! (! г=4 мл геля). Предиазиачеииый для связывания лигаид (белок или иизкомолекуляриос вещество) растворяют в воде или водпом растворителе и доводят рН до 4,5. К ссфарозе добавляюг такой объем водного раствора гидоохлорида 1-этил- 3-(З-диметиламинопропил)карбодиимида, чтобы получилось 10 мг набухшего геля иа 1 мл. Гель и карбодиимид перемешивают в течение ночи при комнатной температуре (иельзя использовать магнитную мешалку).
Избыток реактивов удаляют промываиием той же смесью воды и растворителя, которая будет использована иа последующем этапе связывания лигаида. Полученный коцъюгат можно хранить при 4 — 8'С. Предпазиачеииый для связывания лигаид растворяют в воде или смеси воды и растворителя, доводя рН водной фазы до 4,5, при этом никакого буфера ве используют. Величину рН, которая снижается, главным образом в начале реакции, поддерживают иа уровне 4,5, добавляя НЕОН. Связаииый с лигаидом гель тщательно промывают связывающим раствором; иет необходимости блокировать избыточные группы.
После промывки в дистиллированной воде, а затем в буфере гель готов для использоваиия в аффиииой хроматографии. Материал можно хранить при рН 7,0 и температуре ниже 8'С без замораживаиия. Получение замен!енного агарозо-аффи-геля 10 Агарозо-аффи-гель 10, используемый в аффиииой хроматографии, производится фирмой В!о-(тай 1.аЬога(олез в виде влажной пасты (1 г сухого веса/25 мл). 2!9 ЧАСТЬ ГЧ МЕТАБОЛИЗМ Удлиняющий «мостик» и сукцинимндную группу присоединяют к матрице (биогель Л) через сукцинилированную аминоалкн.яьную группу, Гель промывают на фильтре водой объемом, превышающим в 3 раза объем самого геля. Затем гель смешивают с буфером, например с 0,1 М ацстатом, морфолинпропансульфоновой кислотой (МОПС), 5)-тряс(гидроксиметил)метил-2-амииоэтансульфоновой кислотой (ТЕС) или НСОА (рН 5 — 8,5).
Лнгаид можно также добавлять в неводном растворителе прямо во влажный сгусток геля или в гель, промытый и суспендированный в растворителе. Применение связанных с лигандаяи аффинных сорбентов 1х01 Количество необходимого материала для разделения определяют по известной или найденной емкости данного сорбента с некоторыми допугцениями в отношении экспериментальных чсловий, сродства сорбируемого материала и т. д. Обычно используется избыточное количество сорбента, и адсорбироваиные вешества образуют полосу только в верхней части хроматографического слоя, поэтому можно работать с небольшими колонками. Как н при гель-фнльтпации, колонки набивают так, чтобы слой сорбента был равномерным н проницаемым для подвижной фазы. Для адсорбции следует выбрать такой стартовый буфер, который обеспечил бы максимальное связывание, например, белка с лигандом н минимальное взаимодействие между молекчлами белка.
Таким образом, необходимо учитывать рН и присутствие в реакционной смеси специфических ионов или каких-либо веществ, а буфер должен иметь высокчю ионнчю силу, например содержать 0,5 М МаС1. Пробу вводят в стартовый буфер, и при необходимости ион, содержащийся в пробе, замещают ионом буфера с помощью диалнза, мембранного фильтрования или гель-фильтрации.
Элюированис может происходить в результате одного или нескольких сдвигов рН, изменения ионной силы илн замещении иммобилнзованного лиганда родственным или идентичным веществом. Прн использовании первых двух способов специфичность, характерная для 220 !к Физические методы аффиниой хроматографии, проявляется только на стадии адсорбции. При элюировании путем специфического замещения иммобилизованного лиганда специфичность проявляется как на стадии адсорбции, так и в процессе элюирования, Другие аспекты В тех случаях, когда высоко реакционноспособный носитель предстоит связать с макромолекулами, отличающимися большой чувствительностью к избыточному количссзву центров связывания, может потребоваться сократить число связываю*.пих групп в матрице. При использовании СХВг-сефарозы и некоторых других материалов это достигаетгя пчтем регулируемого гидролиза реакционноспособных групп, в других же случаях— с помощью предварительной контролируемой обработки матрицы низкомолекулярным лигандом.
Даже при отсутствии у макромолскул такой чувствительности вполне вероятно, что в процессе их связывания с носителем произойдет некоторое нарушение макромолекулярной структуры. У ферментов это проявляется в уменьшении удельной активности и других изменениях каталитических свойств. После завершения процедчры связывания лигаида с матрицей все оставшиеся реакциоиноспособные места на матрице следует инактивировать добавлением избытка низкомолекулярного вещества, содержащего ту же реакционноспособную группу, например к сефарозе, активированной С1ЧВг, добавляют этаноламин.
16.3.7. Гель-фильтрация 118, 271 С помощью сферических гранул с относительно равномерно распределенными по размерам порами можно осуществить различные виды молекулярного разделения, основанные в значительной степени на различиях в размерах молекул. Когда пробу вводят в колонку для гель-фильтрации, наслаивая ее на гель, те молекулы, которые по своим размерам намного крупнее пор сферических гранул, проходят через колонку, вытесняя растворитель и не проникая в гранулы.
Оии выходят в ви- 221 ЧАСТЬ Ш МЕТАБОЛИЗМ де пиков сразу же после того, как через колонку пройдет свободный, илн внешний, объем растворителя ()ть). Мелкие молекулы, которые свободно уравновешиваются с растворителем во внутреннем пространстве гранул 1внутренннй объем У,), теоретически должны пройти с элюентом через колонку, как если бы гранул вообще нс было, и выйти после того, как пройдет общий объем колонки. Молекулы, занимающие промежуточное положение между этими крайними случаями, «распределяются» в пространстве, находящемся внутри и между грануламн, главным образом в соответствии со своими размерами.
Благодаря тому что материалы, используемые для гель-фильтрации, имеют поры самых разных размеров и, следовательно, различаются по своим диапазонам фракционирования, с их помощью можно разделять вещества с молекулярными массами в пределах от 1 10' до 5 10'. Если одни молекулы ведут себя «идеально», как это описано выше, то многие другие задерживаются на колонке дольше, чем ожидается.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
