Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 41
Текст из файла (страница 41)
Температуру колонки поддерживают в течение 7 мин при 88'С, а затем повышают ее до 165'С со 2!2 м ьнзнчвскив методы скоростью 7,5 'С в ! мнн. Температуру детектора и дозатора устанавливают при 230 'С. Анализ щавелевоуксусной, пнровиноградной н и-кетоглутаровой кислот с помощью этой методики сопряжен с некотоРыми трудностями, которые, однако, удалось преодолеть благодаря получению триметилсилилоксимных производных этих кислот (401. 16.3.5. Жидкостная хроматография под высоким давлением Разрешающая способность распределительной хроматографии в системе жидкость — твердый носитель повышается с уменыпеннем размеров частиц носителя, так как при этом увсличиваегся число циклов разделения н ускоряется усгановленне равновесия между растворенными веществами и стационарной фазой. Эти положительные явления сопровождаюгся сильным снижением скорости потока, которую можно повысить до приемлемого уровня только с помощью достаточно высокого давления.
Жидкостная хроматография под высоким давлением (ЖХВД) — это новая и быстроразвивающаяся область с большими аналитическими и препаратнвными возможностями. Все элементы этого метода, включая твердую насадку, предназначены для работы под давлением от 7 до 550 кг/см'. Разделение может быть основано на принципах адсорбции„распределения (в том числе обращенно-фазоный и ионпарный варианты) и ионного обмена (24, 28]. Оборудование Простая и относительно недорогая система включает насос, создающий высокое давление, манометр, клапан для ввода проб, колонку и коллектор фракций или проточный абсорбционный детектор.
Жидкость в насос может подаваться с помощью простого устройства для создания градиентов. Бее соединения, крепления и колонка должны быть из нержавеющей стали. Набивку колонки при использовании некоторых твердофазных ма- 2!3 чАсть 1ч. метАГолизм терналов можно осуществлять в лаборатории, Однако во многих случаях удобно пользоваться готовыми колонками. Сорбенты для ЖХВД Для ЖХВД применяют сорбенты двух типов: сферические стеклянные шарики с пористой поверхностью (или с нанесенным на поверхность пористым слоем) и пористые микрочастицы неправильной формы. Связанный со стеклом тонкий пористый слой на поверхности стеклянных шариков (диаметром 37 — 43 мкм) имеет толщину около 1 мкм.
В этом слое и происходит распределительное, ионообменное, а иногда адсорбцнонное разделение исследуемых веществ. Поскольку набивка колонки такими шариками легко осуществима, их рекомендуют применять в общих или не очень сложных случаях, а также для набивки колонок в лаборатории. Пористые микрочастицы (диаметром 5 — 20 мкм, чаще всего !О мкм) — это близкие по размерам частицы силикагеля или окиси алюминия, используемые для адсорбционного разделения; силикагель служит также основой для других покрытий, которые связываются с ннм через силанольные группы. Емкость и разрешающая способность такой колонки с площадью поверхности около 100 м'(г, намного превышающей площадь поверхности шариков, значительно выше.
В качестве покрытий применяют полярную цианоамнновую фазу, Сиообращенную фазу, а также сильные анионо- и катионообмеиннки. Для стеклянных шариков, помимо назнанных, используют полиамидное покрытие и слои слабых аннонообменннков. Выбор сорбента и подвижной фазы В литературе описано довольно большое число методов ЖХВД, и поэтому, прежде чем пытаться подобрать условия для хроматографического разделения, манипулируя множеством переменных параметров, следует поискать уже опубликованное описание методики, применимой к данной конкретной ситуации. Если такой методики нет, то рекомендуется обратиться к тонко.
214 !О ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ слойной хроматографии для подбора подходящего растворителя. В первом приближении водонерастворимые вещества можно разделить путем адсорбции с последующим элюированием в смеси спирт — алкан (5: 95) илн хлороформ — гептан (1О: 90) либо на полярной цианоаминовой фазе, используя для элюции смесь изопропанол — гептан (2: 98). Водорастворимые ионизирующиеся вещества, если они проявляют кислотные свойства в растворе, разделяют на сильных анионообменниках; если же они представляют собой основания, для их разделения применяют сильные катионообменники.
Эл4оирование можно с успехом провести, используя в первом случае 0,1 М КНЗР04, рН 3,0, а во втором— 0,2 М 5(Н4НЗР04, рН 3,5. Если при использовании покрытий, в которых происходит распределительная хроматография, растворенное вещество элюируется с фронтом, злюент делают более полярным, если же для элюироваиия вещества требуется более 30 мин, то применяют менее полярный элюент.
В том случае, когда при ионообменной хроматографии образец не связывается с сорбентом, следует снизить ионную силу элюента; если же образец элюируется с большой задержкой, надо повысить ионную силу. Аминокислоты разделяют на пористых микрочастицах, представляющих собой сильные катионообмениики, углеводы — на цианоаминовых полярных фазах, нуклеотиды и циклические нуклеотиды — на сильных анионообменниках, олигонуклеотиды — на обменниках, содержащих алифатические амины, а водорастворимые витамины — на сильных катионообменниках.
Это лишь немногие примеры широкого использования ЖХВД. Разделение триптичееких пептидов 139] Аналитическое картирование пептидов триптических гидролизатов белков можно осуществлять с помощью стандартного оборудования для ЖХВД, снабженного приспособлением для создания линейного градиента. Используется готовая обращенно-фазовая колонка С44рбондапак (10 мкм, 4 мм,'44',30 см, %а(егз Аззос(а(ез, МВ1огб).
213 ЧАСТЬ Щ МЕТАБОЛИЗМ Лля получения триптического гидролнзата белок, диализованный против дистиллированной воды и затем лиофилизированный, растворяют в 0,2 н. М-этилморфолинацетате (рН 8,1) до концентрации 1 мг~мл и инкубируют с трипсином при соотношении трипснна и белка 1: 100 в течение 16 ч при 37'С. Гидролиз прекращают добавлением уксусной кислоты, после чего образец гидролизата вводят непосредгтвенно в колонку для ЖХВАА Пептиды элюируют пон комнатной температуре в линейном градиенте 0,1'/О-ная ортофосфорная кислота— ацетонитрил при скорости потока 2 мл)мин и давлении 34 1Оз — 68 10' Па. Фосфорную кислоту фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,5 мкм (М11- 11роге Согр., Веб)огг)), ацетонитрил используется без какой-либо подготовки.
За разделением пептидов можно следить, измеряя оптическую плотность элюата при 210 нм; для этого либо вручную отбирают пробы, либо используют детектирование в потоке. 16.3.6. Аффинная хроматография Аффинная хроматография основана на использовании равновесного состояния высокоспецифического связывания, встречающегося в биологических системах. Этот метод позволяет осуществлять такое разделение веществ, которое невозможно достичь с помощью других способов [19, 20, 22). Стть метода заключается просто в иммобилизации одного из компонентов обратимо связывающейся системы на твердом носителе и последующем его взаимодействии с другим компонентом 1компонентамн) этой равновесной системы, приводящем к отделению сопутствующих примесей.
Таким образом, разделение основано на специфическом связывании компонентов данной системы, а не на различиях в их физических и химических свойствах. Методы аффинной хроматографии хорошо разработаны. Они используются для разделения и очистки компонентов таких высоко- специфически связывающихся комплексов, как антиген — антитело, гормон — связывающий белок, фермент— лиганд. Основными факторами, определяющими процесс разделения, являются природа и химическая струк- 216 м Физические методы Тура матрицы, механизм взаимодействия лиганда с матрицей, наличие удлиняющего «мостика», а также условия сорбции и элюции подвижного связываемого компонента системы.
Более подробная информация по этому вопросу содержится в обзорных статьях 119, 20~ и в брошюрах, выпускаемых фирмами-изготовителями. В продаже имеется много различных материалов, применяемых в аффинной хроматографии, в том числе матрицы, или носители, причем связанные с ними удлиняющие «мостики» могут содержать на конце различные функциональные группы или присоединенные к цим широко используемые лиганды, такие, как аденозин- 5'-монофосфат. Декстраны, например сефароза 4В (РЬаппас(а Рше СЬепнса!з) и агарозы, такие, как биогель А (В!о-1(ад БаЬога1ог1ез1, обладают стабильностью, обеспечивают достаточную скорость потока и имеют удобные размеры частиц, что делает их пригодными для использования в качестве матриц.
Разработана химия модификации этих материалов, позволяющей расширить спектр их применения. В случае сефарозы 4В ее связывание с лигандами с помоцтью аминогрупп осушествляют после активации матрицы бромцианом (32!. Частицы сефарозы 4В сферической формы можно изготовить в лаборатории, но оии имеются и в продаже, причем в активированной форме. Если лиганды небольших размеров можно присоединять непосредственно к актнвированной сефарозе 4В, то крупным лигандам, таким, как белки, часто мешают при этом стерические препятствия, поэтому реакция между матрицей и лигандом протекает медленно и не до конца.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
