Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 52
Текст из файла (страница 52)
Для удаления из гелей додецилсульфата натрия, содержащегося в концентрации до 0,1%, гели перед окрашиванием промывают несколько раз смесью 10%-ной (вес/объем) трихлоруксусной кислоты и 33% -ного (объем«объем) водного раствора метанола. Приготовление раствора красителя для белков. К 1 части 0,2%-ного водного раствора (вес/объем) кумасси яркого синего 6250 добавляют 1 часть 2 н. Н,ЗО, и оставляют на 3 ч. Осадок удаляют фильтрованием через хроматографическую бумагу «1«Ьа1шап № 1 и к раствору добавляют «/9 объема 10 н.
КОН. Затем приливают 100%-ную ТХУ до конечной концентрации 12% (вес! /объем) . Гели помешают в раствор красителя на 5 — 8 ч. Окрашенные гели хранят в воде для достижения большей чувствительности. При хранении в кислотах интенсив«ость полос снижается. Этот метод позволяет получать линейные показания денситометра для белков (сывороточного альбумина) в интервале от 1 до 20 мкг.
Обесцвечивание. При окрашивании гелей по описанной выше методике фон остается прозрачным н не требует обесцвечивания. Однако во многих случаях после окрашивания необходимо проводить обесцвечивание фона. Это можно делать либо с помощью электрофореза, либо путем выщелачивания избытка красителя. Электрофоретическое обесцвечивание возможно в том случае, если краситель прочно связывается с белком, иначе некоторые полосы могут исчезнуть. Кроме того, для этих целей необходимо специальное приспособление.
Тем не менее этот способ отличается быстротой и дает более светлый фон. Для выщелачивания избытка красителя гели просто погружают на несколько часов в растворитель для красителя, обычно в уксусную кислоту. регистрация результатов и расчеты. Результаты разделения можно зарегистрировать самым простым способом, сделав схематические изображения окрашенных ЧАСТЬ 1У. МЕТАБОЛИЗМ гелей. Более точные количественные измерения производят на основе: 1) фотографий окрашенных гелей и последующего денситометрического сканирования негатива; 2) оптического сканирования окрашенных или неокрашенных гелей (280 нм) с регистрацией оптической плотности по длине геля с помощью самописца; 3) элюирования и анализа небольших сегментов (тол1циной 1 мм), полученных при разрезании цилиндрических гелей, или разжижения гелей и разделения их на фракции.
Для выявления ферментов часто используют следующую методику: сразу после электрофореза гель помещают в реакционную смесь, содержащую субстрат исследуемого фермента и какую-либо систему, обеспечивающую образование окрашенного продукта. После ннкубирования геля в течение нескольких минут в нем появляется окрашенная зона, расположенная в том месте, где диффундирующие реагенты входят в контакт с ферментом.
Если же реагенты не диффундируют в гель, то в результате реакции, происходящей на поверхности геля в зоне фермента, образуется кольцо. Молекулярная масса нативных белков Для определения молекулярной массы олигомсрных белков широко применяется метод Хедрика и Смита 1741, поскольку гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (в том варианте, который описан ниже) обычно приводит к диссоциации таких белков на мономеры с конформацией статистического клубка.
Чтобы применить этот метод к нативным белкам, необходимо построить график зависимости 1дР (логарифма отношения расстояния, на которое мигрировал данный белок, к расстоянию от старта до фронта красителя) от концентрации геля для каждого исследуемого и стандартного белка. С этой целью проводят электрофорез при нескольких концентрациях геля„ т. е. при различной степени сшивки (рис. 16.12, Л). В результате получают ряд прямых с разными углами наклона.
Зависимость тапгенсов этих углов от молекулярных масс соответствующих белков также носит линейный характер. Для отражения этой зависимости строят второй график, используя стандартные белки с известными молекуляр- 270 1б Физические метОды ятаяенугярная масса Конагнврааия геля Рис. 16.12. А. Зависимость относительной подвижности (мм) от степени поперечной сшивки (концентрации геля) для нескольких стандартных белков. Б. Зависимость наклонов прямых, представленнмх на рис. А, от молекулярных масс стандартных белков.
Светлые кружки соответствуют неизвестному белку. ными массами. Затем для неизвестного белка откладывают значения логарифма )с против значений концентрации геля. По величине наклона полученной прямой на втором калибровочном графике находят молекулярную массу неизвестного белка. Методика. Приготовление геля и электрофорез проводят в основном так, как описано выше в разделе, посвященном общим сведениям о гель-электрофорезе. Единственное различие состоит в том, что образец, разбавленный растворителем (см. ниже) в соотношении 1: 1, осторожно наслаивают между концентрирующим гелем и буфером.
После электрофореза фронт растворителя отмечают, вводя на этом уровне в столбик геля медную проволоку (№ 32). Гели окрашивают, как описано выше. Затем определяют значение Я для каждого геля и строят график зависимости 1дй от концентрации геля (по меньшей мере для четырех концентраций). Наклоны полученных прямых для исследуемых и стандартных белков откладывают против молекулярной массы каждого из них (рис. 16.!2,Б). Молекулярную массу неизвестных белков определяют по калибровочному графику зависимости наклона — молекулярная масса. 27! ЧАСТЬ ГЧ.
МЕТАБОЛИЗМ Разделяющий бьй-ный гель, рН 7,уг 5 частей раствора А (трис-НС1, 0,48 М по С1- плюс 0,46 мл. )Ч,Ылн;)н'-тетраметилзтилендиамина (ТЕМЭД) на 100 мл раствора, рН 7,9). 1О частей раствора Б (24 г акриламида и 0,8 г БИС на 100 мл). 5 частей воды. Необходимая для этой работы концентрация геля варьирует от 3 до 16о/о. Гели готовят, разбавляя концентрированный раствор Б до нужной концентрации (в приведенном выше примере до 6'/е). Зто-ный гель содер. жит 12 г акриламида и 0,4 г БИС на 100 мл раствора. Концентрирующий гель, рН 5,7: 2 части раствора В (имидазол-НС1, 0,48 М ио С1-, рН 5,7) 2 части раствора Д (4 мг рибофлавина иа 100 мл) 4 части раствора Г (1О г акриламида н 2,5 г БИС на 100 мл) 8 частей воды.
Растворителе для образца, рН 5,7: Имидазол-НС1, 0,06 М по С1- в 50ть-ном глицерине. Электродный буфер: 0,034 М аспарагин и 5 1О-ьь(ь-иый раствор бромтимолового синего, доведенный трисом до рН 7,3 Молекулярная масса денатурированных мономерных белков или субъединиц олигомерных белков Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) позволяет снизить до минимума влияние зарядов белков на их подвижность, которая в этих условиях зависит только от размеров молекул. Под действием ДСН третичная и вторичная структуры белков разрушаются.
Для определения молекулярной массы очишенных белков, а также мембран, рибосом и т. д. широко используется метод Вебера и Осборна ~~801. ДСН высвобождает и солюбилизирует компоненты этих структур, которые невозможно растворить никаким иным способом. В этом методе используется только одна концентрация геля, и график зависимости относительной подвижности (отнотпение расстояния, пройденного фронтом красителя, к расстоянию, пройденному зоной белка) от логарифма молекулярной массы имеет линейный харнк- 272 и физичвскиа мвтоды тер в довольно широком диапазоне значений молекулярных масс.
Таким образом, молекулярную массу неизвестного белка можно определить по графику, построенному на основании данных для белков с известными молекулярными массами (рис. 16.12,Б). При данной концентрации геля, например 10$, график будет линейным в диапазоне молекулярных масс от 10000 до 100000 171). Для других концентраций геля этот диапазон может быть шире или уже. Методики. Разделяющий гель, содержащий ДСН, приготавливают так, как это описано выше для электрофореза в неоднородной («прерывистой») системе. Однако в данном случае концентрирующий гель не используется и образец наслаивают непосредственно на поверхность разделяющего геля. Растворы белков (0,2 — 0,6 мг/мл) инкубируют при 37'С в течение 2 ч в 0,01 М натрнй-фосфатном буфере, РН 7,0, содеРжащем 1э4 ДСН и 17э 8-меРкаптоэтанола.
Для полного развертывания полипептидных цепей и диссоциации белковых субьединиц иногда необходимо прокипятить раствор, добавить к нему мочевину до концентрации 8 М и (или) восстановить и карбоксиметилировать тиоловые группы 1701. Во многих случаях раствор можно использовать непосредственно без всякой обработки, но, если проведению электрофореза мешают соли, образец диализуют в течение нескольких часов при комнатной температуре против 500 мл 0,01 М натрийфосфатного буфера, рН 7,0, содержащего 0,1'/з ДСН и 0,1 % )1-меркаптоэтанола. Для приготовления образца смешивают в маленькой пробирке 3 мкл красителя (0,05а/з-ного раствора бромтимолового синего), 1 каплю глицерина, 5 мкл 8-меркаптоэтанола и 50 мкл раствора А (см.
ниже). Затем добавляют 10 — 50 мкл раствора белка, смесь перемешивают н наносят на поверхность геля. Раствор А, разбавленный в соотношении 1: 1, осторожно наслаивают на образец до самого верха пробирки. Электродные сосуды заполняют буфером раствора А, разбавленным в два раза. Используют трубки размерами 1О смХ6 мм ~[80). Электрофорез проводят при постоянном токе, причем сила тока составляет 8 мА на 1 трубку. Разделение продолжается в течение 4 ч. После электрофореза гели из- 273 ЧАСТЬ ПЛ МЕТАбОЛИЗМ влекают, окрашивают и измеряют, как обычно.
Для отметки фронта растворителя используют медную проволоку № 32. Обычно на столбик геля наносят 10 мкг белка, но если краситель достаточно чувствителен для детектирования полосы, можно брать и меньшее количество белка. При нанесении на гель 100 мкг белка полоса имеет четкий передний фронт и размытый «хвост».
Однако измерения в зоне переднего фронта дают хорошие результаты. !03д-нмй разделяющий гель; 15 час~ей дезаэрированного раствора А (0,78 г гчаНэРОг НгО, 3,85 г 14агНРОг ТНгО и 0,2 г ДСН на 100 мл). 13,5 частей раствора Б (22,2 г акриламида и 0,6 г БИС на 100 мл), отфильтрованного через бумагу %5а1шап № 1. Хранят в темной склянке при 4'С. Для получения нужной степени сшив. ки использугот разное количество БИС. После смешивания растворов А и Б смесь дезаэрируют.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
