Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 56
Текст из файла (страница 56)
Осадок собирают на фильтре, фильтрат выбрасывают. Пробирку дважды споласкивают 2 мл охлажденной 10%-ной ТХУ и 1 раз 3 мл охлажденного 70%-ного этанола и наносят эти растворы на фильтр для удаления остатков ТХУ, которая в противном случае приведет к солюбилизации некоторой части белка на следующем этапе. 4. Фильтр дважды промывают 5 мл 70%-ного этанола (45'С) и дважды 5 мл смеси этанол — диэтиловый эфир при 45'С. 5.
Фильтр высушивают на воздухе, помещают в сцннтилляционный флакон и сушат под лампой накаливания. 6. Определяют радиоактивность высушенного на ,фильтре белка в сцинтилляционной смеси на основе .толуола (равд. 16.4,3). 1х химичвскии сОстАВ 17.1,8. Применение методов фракционировииия Описанные выше методики обычно применяют для фракцнонирования бактериальных клеток, меченных одним из компонентов среды, который неспецифическн включается во все молекулы клеток. При ннкубироваиин бактериальных клеток в присутствии специфического предшественника макромолекулярного вещества для измерения скорости его синтеза важно определить, что данное вещество содержит всю радиоактивность.
Это делают путем фракционирования клеток и подсчета радиоактивности каждой фракции по описанным выше методикам. Если в изучаемой фракции содержится вся радиоактивность, то дальнейшие эксперименты можно упростить. Например, если для определения количества синтезируемой ДНК применяется радиоактивный тимидин и в предварительных опытах показано, что он не включается в другие фракции, то клетки в культуральной среде обрабатывают следующим образом. Среду охлаждают и добавляют к ней охлажденную 10'Уз-ную ТХУ.
Осадок, содержащий ДНК, собирают на фильтре, промывают охлажденным этанолом, высушивают и подсчитывают в нем радиоактивность. Эта методика применима для определения количества синтезируемой ДНК, а также белка или РНК, если предшественник последних обнаруживается только в одной фракции. При определении скорости синтеза различных веществ учитывают и другие факторы.
Прежде всего это разбавление добавляемых извне субстратов немеченымн предшественниками, имеющимися в клеточных пулах. В кинетических экспериментах необходимо определить скорость насыщения пула радиоактивными предшественниками. В описанных выше методиках при использовании для оценки распределения радиоактивности "С-соединений некоторые клеточные компоненты не учитываются.
Например, во фракции РНК оказываются продукты гидролиза тейхоевых кислот и полифосфатов„ а вместе с белком осаждается пептидогликан. Поли р-гидроксибутират, если он присутствует, можно экстрагировать смесью хлороформ — метанол (2: 1, объем/объем) при 60'С после промывания смесью эфир — этанол. В случае применения указанных раство- 291 ЧАСТЬ ПГ.МЕТАБОЛИЗМ рителей фильтры должны быть устойчивы к метанолу и хлороформу, а экстракцню следует проводить в вытяжном шкафу (разд. 17.3.1). Полнсахарнды частично экстрагируются охлажденной ТХУ и могут существенно влиять на оценку радиоактивности низкомолекулярных веществ.
Большие количества полисахаридов создают серьезные трудности при применении неспецифических предшественников, таких, как радиоактивная глюкоза. В этом случае применяют модифицированные методики (3). У некоторых бактериальных клеток пулы низкомолекулярных веществ частично утрачиваются во время центрифугирования и промывания.
Ряд бактерий обладает высокой нуклеазной или протеолитической активностью, которая может во время их сбора или промывания еще больше возрастать. Если на первых этапах брать меньшие количества исходного материала, чем указано в методике, происходят значительные потери высокомолекулярных веществ. Чтобы улучшить осаждение макромолекул, в качестве носителя можно добавлять немеченые бактериальные клетки. ДНК и белок лучше осаждаются при добавлении к растворам сывороточного альбумина. Фракционирование каждого нового микроорганизма потенциально представляет собой проблему. Хотя описанные здесь методики широко применяются на практике, при интерпретации результатов каждый раз следует проверять, достигнуто ли полное разделение низко- и высокомолекулярных веществ (3).
Другие методы обработки образцов описаны в работах 12, 31. Однако при их применении вероятность перекрестного загрязнения фракций выше, чем в описан,ной здесь процедуре. 17.2. УГЛЕВОДЫ Бактерии содержат много различных углеводов: сво'бодные сахара, производные сахаров, простые полисахариды (полимеры, состоящие из одного сахара или производного сахара, такие, как гликоген), сложные полисахариды (полимеры, состоящие из нескольких сахаров, аминосахаров, уроновых кислот и т. д.) и макро- 292 гь химический сОстАВ молекулы, включающие углеводные и неуглеводные компоненты (липополисахариды, пептидогликаны, тейхоевые, липотейхоевые, тейхоуроновые, нуклеиновые кислоты, гликопротеины и т. д.). Колориметрические методы, основанные на пробе Молиша на углеводы (4, 7, 8), пригодны для количественного определения простых сахаров и их полимеров.
Специальные методики определения пентоз в нуклеиновых кислотах (рибозы и дезоксирибозы) описаны ниже в разделе, посвященном нуклеиновым кислотам (разд. 17.5.1 и 17.5.2). Более полные описания аналитических методов определения углеводов сделаны Гербертом и сотр. (5) и Коловиком и Капланом (4). 17.2.1. Определение общего количества углеводов антроповым методом Наиболее удобные способы определения общего количества углеводов включают нагревание среды, клеток или выделенных углеводов с серной кислотой с целью гидролиза полисахаридов, а также дегидратации моносахаридов. При этом из пентозы образуются фурфуролы, а из гексозы — гидроксиметилфурфуролы.
Затем растворы фурфуролови гидроксиметилфурфуролов обрабатывают реактивом (ароматическим амином или фенолом) для получения окрашенного соединения, которое анализируют колориметрически или спектрофотометрически. Описано много вариантов этой методики, называемой пробой Молиша 14, 7, 81. В этих реакциях пентоза, гексоза н гептоза, а также их производные (за исключением аминосахаров) дают окрашенные вещества, тогда как триоза и тетроза не образуют хромофоров. Нн одна из этих методик не позволяет точно определить все углеводы, содержащиеся в бактериях, так как для разных сахаров интенсивность окраски при данной длине волны различна 151. Описанные ниже методики с использованием антрона и фенола отличаются простотой. При их выполнении почти не мешают другие клеточные компоненты, а наиболее распространенные в микробных клетках гексозы дают сходную реакцию, что обеспечивает надежное определение общего содержания углеводов.
члстыч. метлволизм Обе методики позволяют определять общее количество углеводов в бактериальных клетках, содержащих )10% полимеров гексозы. При низком содержании гексоз в клетках пентозы в нуклеиновых кислотах мешают определению. Реактивы и оборудование Физиологический раствор: 0,85з/з-ный (вес/объем) раствор НаС! в дистиллированной воде. Основной раствор глюкозы: 100 мг глюкозы растворяют в 100 мзь 0,157юной (вес/объем) бензойной кислоты, используемой в качестве консерванта. Хранят прн 5 'С.
Раствор годен в течение нескольких месяцев. Перед использованием раствор разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1: !О для получения концентрации глюкозы 100 мкг/мл. Из разбавленного раствора готовят стандартные (10 — 100 мкг/мл) растворы глюкозы. Раствор серной кислоты (75%-ный, объем/объем): 750 мл концентрированной чистой серной кислоты (ч. д. ал геакеп1-кгабе) добавляют к 250 мл дистиллированной воды.
(Внимание! Кислоту медленно вливают в воду, находящуюся в сосуде из пирекса. Нельзя вливать воду в кислоту. Другие предосторожности описаны, в равд. 17.2.2). Антроновый реактив: 200 мг антрона добавляют к 5 мл абсолютного зтанола и разбавляют до 100 мл 75з/з-ной Нз50е (Предостереасение/ См. равд. 17.2.2.) Перемешивают до растворения. Ежедневно готовят свежий раствор н хранят его в холодильнике. Толстостенные пнрексовые термостойкие пробирки размероы 15Х2,5 см.
Спектрофотометр или колориметр. Стеклянные кюветы. Методика Гзактериальные клетки отмывают от компонентов среды центрифугированием при 5000 й" в течение 10 мин. Осадок суспендируют в физиологическом растворе н вновь центрнфугнруют. Осажденные клетки ресуспендируют в дистиллированной воде, отбирают пипеткой пробы клеточной суспензии (0,1 — 1,0 мл) и вносят нх в термостойкие пробирки.
Объем во всех пробах доводят дистиллированной водой до 1 мл. Готовят контрольную пробу дистиллированной воды (1,0 мл) и стандарты„ содержащие от 10 до 100 мкг глюкозы в 1,0 мл. Пробирки и антроновый реактив ггхлаждают в бане со льдом. Добавляют б мл охлажденного антронового реак- 17. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ тива, быстро перемешивают, встряхивая пробирки в ледяной воде, и затем продолжают перемешивание в ледяной бане в течение 5 мин. Пробирки переносят в кипящую баню ровно на 10 мин, после чего помещают их в ледяную воду. Измеряют интенсивность окраски в каждой пробирке с помощью спектрофотометра или калориметра при длине волны 625 нм (равд.
16.1.1). Концентрацию глюкозы в пробах определяют по калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью стандартных растворов и концентрацией глюкозы. 17.2.2. Определение общего содержания, углеводов в реакции с фенолом Реактивы и оборудование Фенольный реактив: 5 г чистого (ч. д. ал геааепбнгабе) фенола растворяют в 100 мл дистиллированной воды. (Осторожноl Фенол вызывает тяжелые ожоги кожи и глаз. При работе с ним нужно надевать защитные очки, перчатки и одежду. Нельзя иасасывать его в пипетку ртом,) Конпевтрированная чистая (ч. д. ал геааепбнгабе) серная кислота. (Меры предосторожности при работе с ней см. ниже.) Стандартные растворы глюкозы (см. выше описание методики с ант ном).
олстостенные пирексовые термостойкие пробирки размером (бк 2,5 см. Спектрофотометр или колориметр. Стеклянные кюветы. Методика Анализируемые пробы вносят пипеткой в толстостенные пирексовые пробирки. Объем в каждой пробе доводят дистиллированной водой до 1,0 мл. Готовят контрольную пробу с 1,0 мл дистиллированной воды и серию стандартных растворов глюкозы с концентрациями от 10 до 100 мкг/мл. Во все пробы добавляют 1 мл фенольного реактива, быстро и тщательно перемешивают.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
