Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 55
Текст из файла (страница 55)
Колба для фильтрования под вакуумом на 125 мл и пробирки, обрезанные таким образом, чтобы при помещении в колбу они доходили до держателя фильтра. Пробирки служат для сбора филь|разов. Инфракрасная лампа для нагревания мощностью 250 Вт и рефлектор для высушивания проб. Баня с ледяной водой. Водяные бани: температура регулируется до 80'С.
Пентрифуга с охлаждением; скорость до 10000 я, ротор рассчитан на 30-мл центрифужные пробирки. 17.1.2. Мечение клеток (Предостережение) Применение радиоактивных изотопов строго контролируется. Персонал, работающий с нзотопами, должен быть знаком с соответствующими правилами (разд. 16.4.1).
Необходимо соблюдение всех предосторожностей.) Количество используемой культуры зависит от типа микроорганизма и условий его роста. Например, для получения 10 мг клеток Е. Со(1 достаточно 30 мл культуры, собранной в середине фазы экспоненциального роста. Для определения состава клеток требуется равномерно меченный субстрат, например "С-глюкоза (5 мкКИ/30 мл культуры, содержащей 1о)з глюкозы в 285 ЧАСТЫУ. МЕТАБОЛИЗМ качестве единственного источника углерода).
Включение аминокислоты в белок можно измерить, добавив меченую аминокислоту (2 — 5 мкКи) к 30 мл культуры, растущей на солевой среде с глюкозой. Для измерения включения определенной аминокислоты в белок идеально подходит ауксотрофный мутант, неспособный ее синтезировать. В этом случае к среде добавляют 10 мкг/мл пемеченой аминокислоты и 2 — 5 мкКи меченой аминокислоты. Важно, чтобы в качестве предшественника меченого белка использовалась неметаболизируемая аминокислота. Лейцин, лизин, фенилаланин и тирозин метаболизируются большинством бактерий в очень незначительной степени.
При работе с меченым тимидином в качестве предшественника ДНК и меченым урацилом или уридином в качестве предшественников РНК также рекомендуется использовать ауксотрофы, чтобы получить хорошее включение метки во фракциях. Для изучения состава клеток обычно используют культуры в фазе экспоненциального роста. Во время лаг-фазы и стационарной фазы состав клеток отличается от состава в экспоненциальной фазе роста. 17,1.3.
Низкомолекуляриые вещества 1. Культуру быстро охлаждают, помещая ее в лед. Радиоактивно меченные клетки (около 10 мг сухого веса биомассы) отделяют от ростовой среды центрифугированием (5000 д, 10 мин, 5'С). Осажденные клетки дважды промывают физраствором ('/з объема культуры), центрифугируя их при 5'С. 2. Клетки суспендируют в 10 мл дистиллированной воды в центрифужной пробирке. Суспензию помешают в ледяную баню и добавляют к ней 10 мл холодной ТХУ. Центрифужную пробирку закрывают крышкой и переворачивают для перемешивания содержимого. Пробирку помещают на 5 мин в ледяную баню для полного выпадения осадка. 3.
Пробирку центрифугируют при 5000 — 10 000 д в течение 15 мин при температуре 0 — 4'С и надосадочную фракцию осторожно декантируют в 25-мл мерную колбу, не взбалтывая осадка. 286 !х химнческии сОстАВ 4. К осадку добавляют 4 мл 1Оз -ной холодной ТХУ, суспендируют его и вновь центрифугируют. Надосадочиую фракцию объединяют с надосадочной жидкостью, полученной после первого центрифугирования, и разбавляют дистиллированной водой до 25 мл.
5. Определяют радиоактивность объединенной фракции, содержащей низкомолекулярные вещества (пул метаболитов) непосредственно в растворе, применяемом для определения радиоактивности в водных образцах, как описано в предыдущей главе (разд. 1б.4.2). Чтобы внести поправку на тушение флуоресценции за счет ТХУ, используют внутренние или внешние стандарты.
В другом варианте ТХУ удаляют путем трехкратного экстрагирования равными объемами эфира. Однако в процессе экстрагирования эфиром из низкомолекулярной фракции удаляются органические кислоты. Радиоактивность в образцах проэкстрагированной фракции измеряют в сцинтилляционной смеси, применяемой для водных растворителей, или же после высушивания под лампой накаливания в сцинтилляционной смеси на основе толуола (разд.
1б.4.3). 17.1.4. Липнды 1. Чтобы выделить липиды из осажденной в центрифужной пробирке фракции макромолекул, осадок суспендируют в 10 мл охлажденной 10%-ной ТХУ во встряхивателе Чог(ех. (Предостережение! Во время суспендирования пробирку следует закрывать во избежание разбрызгивания аэрозолей ТХУ и радиоизотопов.) 2. 1 мл гомогенной суспензии фильтруют и фильтр дважды промывают 2 мл охлажденной 1Оз -ной ТХУ.
Затем для удаления остатков ТХУ, которая может вызывать солюбилизацию части белка на следующем этапе, фильтр промывают 3 мл охлажденного 70~ -ного этанола. Фильтрат выливают. 3. Колбу с фильтром и пробирку для сбора фильтрата помещают в термостат при 45'С. После нагревания до 45'С колбу вынимают из термостата, быстро наносят на фильтр 10 мл 70а -ного этанола (нагретого до 45'С в водяной бане) и ждут, пока растворитель медленно пройдет через фильтр. Фильтрат собирают в пробирку. 287 ЧАСТЫ Ч. МЕТАБОЛИЗМ Для того чтобы прошла экстракция, фильтрование должно длиться 10 мин. 4.
Фильтр промывают в вытяжном шкафу 2 — 5 мл смеси этанола и диэтилового эфира (1: 1, объем/объем), нагретой до 45 'С в водяной бане, медленно пропуская растворитель через фильтр (в течение 10 мин). Филь- трат собирают в пробирку и объединяют с нагретым до 45'С этанолом, использовавшимся для промывания на этапе 3.
Фильтр с остатками осажденной фракции макромолекул сохраняют для дальнейшего фракционирования. 5. Объем объединенных фильтратов доводят до 25 мл, образец высушивают в сцинтилляционном флаконе под струей профильтрованного воздуха при 40'С. Воздух фильтруют, пропуская его под давлением через стекловату.
6. Определяют радиоактивность высушенного образца липидов в сцинтилляционной смеси на основе толуола (разд. 16.4.3). 17.1.5. Рибонуклеиновые кислоты 1. После удаления липидов из осажденной фракции макромолекул можно выделить РНК. Фильтр с осадком вынимают из держателя (см. выше этап 4), помещают в 20-мл химический стакан и высушивают в течение 10 мин на воздухе в вытяжном шкафу. 2. В стакан на фильтр наносят 2 мл 0,5 н. МаОН (подогретого до 37'С) и инкубируют, изредка встряхивая, при 37'С в течение ровно 40 мин. Важно, чтобы фильтр был полностью покрыт раствором НаОН. Более продолжительная инкубация может привести к гидро- лизу некоторых белков 11, 3).
3. Стакан переносят в лед и быстро охлаждают. Добавляют 0,6 мл охлажденной 50%-ной ТХУ, перемешивают и оставляют во льду приблизительно на 30 мин. 4. Раствор переносят из стакана на новый фильтр, укрепленный на держателе, фильтруют под вакуумом и собирают кислоторастворимые вещества в пробирку. К первому фильтру в стакан наливают 3 мл холодной 5% -ной ТХУ, переносят этот раствор на второй фильтр и собирают фильтрат в ту же пробирку, где уже нахо- м. химический состАВ дится первый фильтрат.
Объединенный фильтрат разбавляют в мерной колбе до 15 мл дистиллированной водой. Этот фильтрат содержит около 95% рибонуклеотидов РНК. 5. Определяют радиоактивность гидролизованной фракции РНК так же, как радиоактивность низкомолекулярной фракции (см.
выше и равд. 16.4.3). 17.1.6. Дезоксирибонуклеиновая кислота 1. После удаления лнпидов и РНК из макромолекулярной фракции ДНК выделяют из осажденной фракции макромолекул на фильтре, обрабатывая его горячей ТХУ. В эксперименте используют второй образец„ который получают после суспендирования осадка в холодной ТХУ, как описано для первых этапов фракцноннрования липндов (равд. 17.1.4). Повторяют этапы 1 — 4 по удалению липидов. После промывания фильтра этанолом н смесью этанола н эфира для удаления липидов фильтр помещают в химический стакан, добавляют 2 мл 0,5 н.
5)ЕОН, перемешивают и инкубнруют в течение 90 мин при 37'С. Период ннкубацни с 5)аОН увеличивают для того, чтобы прошел полный гндролиз РНК. ДНК присутствует в меньших количествах, чем РНК, и поэтому следы негидролизованной РНК могут завышать оценку радиоактивности ДНК. Солюбилизация некоторых белков не влияет на результат определения радиоактивности ДНК.
2. Стакан с фильтром охлаждают во льду, добавляют 0,6 мл охлажденной 50%-ной (вес/объем) ТХУ и оставляют во льду на 30 мин. Затем раствор из стакана выливают на новый фильтр, предварительно замоченный в охлажденной 5%-ной ТХУ. Фильтруют под вакуумом. Первый фильтр дважды промывают 3 мл охлажденной 5%-ной ТХУ н фильтрат выливают. 3. Оба фильтра помещают в 10-мл колбу Эрленмейера, добавляют 3 мл 5%-ной ТХУ н нагревают 30 мин на водяной бане прн 80'С. Фильтры при этом должны быть полностью погружены в жидкость.
4. Добавляют 0,1 мл раствора бычьего сывороточного альбумнна (1,0 мг/мл), быстро перемешивают, охлаждают колбу 30 мнн в ледяной бане и фильтруют со- ЧАСТЬ Ис МЕТАБОЛИЗМ держащийся в ней раствор через новый фильтр. Добавлением бычьего сывороточного альбумина обеспечивается более полное осаждение высокомолекулярных веществ, которые в противном случае могут остаться в суспензии.
Для ускорения фильтрации применяют слабый вакуум. Фильтрат собирают в пробирку, помещенную в колбу. Колбу Эрлепмейера и фильтры дважды промывают 3 мл охлажденной 5%-ной ТХУ. Фильтраты собирают в ту же пробирку. Объединенный фильтрат разбавляют водой до 15 мл в мерной колбе, а фильтры выбрасывают. 5. Радиоактивность фракции гидролизованиой ДНК определяют так же, как в случае низкомолекулярной фракции (см. выше и равд. 16.4.3). 17.1.7. Белки 1.
Для выделения белков из осажденной фракции макромолекул используют второй образец осадка, суспендированного в охлажденной ТХУ, как описано в 1-м этапе фракционирования липидов. 1 мл образца вносят в пробирку 15Х!00 мм и разбавляют 1 мл воды до 5%-ной (вес/объем) концентрации ТХУ. 2. Разбавленную пробу нагревают 30 мин при 80'С для гидролиза РНК и ДНК. 3. Гидролизованную пробу охлаждают во льду в течение 30 мин для осаждения белков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
