Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 58
Текст из файла (страница 58)
Пробирки оставляют на 10 мин при комнатной температуре; в это время происходит 51-ацетилирование гексозаминов. Затем пробирки погружают в кипящую воду ровно на 3 мин для разрушения непрореагировавшего уксусного ангидрида. Добавляют 50 мкл 5%-ного раствора К,В,О7, перемешивают и нагревают в кипящей бане в течение 7 мин. Охлаждают и добавляют 0,7 мл окрашивающего реактива (разбавленный в соотношении 1:5 реактив Моргана †Элсо). Смесь снова перемешивают и иикубируют при 37 С в течение 20 мин. Измеряют поглощение пробы в каждой пробирке при 585 нм в 1-мл стеклянных кюветах 1разд. 16.1.1). Суммарное содержание гексозаминов в каждой пробе определяют по стандартной калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью при 585 нм и количеством гексозамина в стандартных растворах (разд.
16.1.1). Глюкозамнн, галактозамии н мурамовая кислота имеют одинаковый коэффициент малярной экстинкции. Применение методики Как упоминалось выше, эта методика непригодна для идентификации гексозаминов в сложных смесях сахаров и их производных. Производные гексозамина, такие, как 5)-ацетилмурамовая кислота, связанная с пептидами (которые могут отщепляться под действием лизоцима), образуют одинаковые окрашенные продукты. 301 члстыу.метлволизм Решающее значение в реакции имеет степень нейтрализации НС) после гидролиза пробы, которая должна быть абсолютной. Поэтому важно тщательно готовить растворы НС) и МаОН и хорошо запаивать ампулы или закрывать пробирки перед гидролизом образцов.
Количественное определение глюкозамина, галактозамина н мурамовой кислоты по отдельности можно проводить с помощью методики, описанной Стьюартом-Туллом (1Б~. Другие тесты на мурамовую кислоту приведены в равд. 17.2.8. 17.2.7. Гексозамины в сложных растворах Гексозамины в сложных растворах, а также образующиеся при гидролнзе смешанных полимеров можно отделить от нейтральных сахаров, мешающих определению в реакции Моргана — Элсона, с помощью ионообменной хроматографии, После очистки гексозамины количественно анализируют по описанной выше модифицированной методике Моргана — Элсона. Реактивы и оборудование 4 н НС1. 1 н. )ЧаОН.
Ампулы для лиофилизации или пирексовые пробирки, имеющие вавинчивающиеся крышки с тефлововыми прокладками. Колонки с даузксом-50 (Н+). Иоиообменную смолу даувкс-50 добавляют (по ! г на каждую анализируемую пробу) к 2 в. ХаОН (20 мл/г смолы). Перемешивают 5 — 1О мин и фильтруют через воронку Бюхнера, Смолу промывают дистиллированной водой (50 мл/г) и медленно перемешивают с 3 н. НС! (20 мл/г). Удаляют НС! фильтрованием через воронку Бюхнера н промывают смолу на фильтре 2 — 5 л лнетнллированной воды для удаления кислоты. Удаляют воду путем отсасывания и сусиеидируют смолы в дистиллированной иоде (1 г/5 мл).
5 мл суспендированной смолы набирают в пастеров- скую пипетку или 3-мл шприц с иглой № 18, у основания которого помещен тампон из стекловаты. К пипетке или шприцу присоединяют резинову1о трубку с зажимом на конце для регулирования потока вытекающего раствора. Необходимо следить, чтобы уровень жидкости не опускался ниже уровня смолы. Вакуумный зксикатор с гранулами )ЧаОН. Воронка с мелкоиористым стеклянным фильтром. Воронка Бюхнера. 1х химнческии состАВ Методика Пробу, анализируемую на гексозамины, перемешивают с 4 н. НС! в маленькой ампуле для лиофилнзации. Количество материала и кислоты зависит от того, какой материал используется. Пробы должны содержать 50— 100 мг (сухого веса) бактериальных клеток нли немного меньше очищенного материала в 3 мл 4 н.
НС1. В каждой пробе должно быть 150 — 500 г гексозамина в 3 мл. Препарат гидролизуют 6 ч при 100'С в запаянной ампуле, через которую предварительно пропускали азот. Оптимальное время гидролиза выбирают исходя из предварительных опытов, в которых пробы обрабатывают НС1 в течение различных периодов времени.
Вначале количество гексозаминов увеличивается до максимума, а затем уменьшается в результате разрушения. Поправку на потери можно сделать добавлением в одну из проб известного количества гексозаминэ 1171. Сначала гидролизат высушивают в вакууме над ХаОН для удаления НС1, а затем в эксикаторе над граиулированиым ЫаОН. Добавляют воду и снова высушивают. Растворяют гидролизат в воде и пропускают через воронку с пористым стеклянным фильтром для удаления нерастворимых веществ. Отфильтрованный гидролизат помещают в колонку, изготовленную из пастеров- ской пипетки, заполненной 1 г ионообменной смолы дауэкс-50.
Колонку промывают 15 мл воды, элюат выливают. Гексозамины элюируют 10 мл 2 н. НС!, элюат высушивают в вакуумном эксикаторе над гранулированным ХаОН. Добавляют 2 мл воды и снова высушивают. Во время сушки гидролизатов и элюировання из колонки под влиянием концентрированной НС1 разрушается значительное количество мурамовой кислоты.
Потери этого соединения могут быть различными, и поэтому при определении суммарных гексозаминов описанная методика часто дает заниженные результаты. Высушенную фракцию гексозамина растворяют в 0,1 мл воды и определяют количество гексозаминов, как описано выше (равд. 17.2.6). Проведение гидролиза делает необязательными обработку 3 н. НС! и последующую нейтрализацию. ЧАСТЬ 1У. МЕТАБОЛИЗМ Применение методики Очистка гексозаминов необходима при анализе сложных полимеров, отличных от пептидогликанов (например, липополисахаридов). Методику можно применять к целым бактериальным клеткам (помня о том, что выход мурамовой кислоты варьирует), а также для определения гексозаминов в культуральных средах.
17.2.8. Мурамовая кислота Мурамовая кислота встречается только как компонент пептидогликанов клеточных стенок бактерий, в том числе цианобактерий. Она присутствует у всех прокарнот, за исключением организмов, относящихся к архебактерням [9, 11, 141. Содержание мурамовой кислоты в клеточной суспензии является показателем присутствия н количества пептидогликанов. Количественный анализ этого соединения используется для определения количества бактериальной биомассы в почвах и воде [10, 141.
Наиболее удобные и специфические способы определения мурамовой кислоты включают щелочную обработку кислотных гидролизатов клеточных стенок для удаления 11-лактата из 3-го положения мурамовой кислоты. Затем проводят количественный анализ 1)-лактата ферментативным методом, описанным Типпером [171, согласно которому молочную кислоту определяют с помощью лактатдегидрогеназы, или же колориметрическим методом Хадзии [121.
Реактивы и оборудование Раствор сульфата меди: 4 г Сц504 растворяют в 100 мл дистиллированной воды. л-Гидроксидифенильный реактив: 1,5 г л-гидроксидифенила растворяют в 95ь)ь-иом (объемуобъем) этаноле. Основной раствор мурамовой кислоты: мурамовую кислоту 151нша Снеш1са! Со., 51. 1.ошэ, Мо) растворяют в воде до концентрации 0,25 мг/мл. Мурамовая кислота содержит Зотэ по весу молочной кислоты, присоединенной эфирной свнэью. 20-мл пробирки, имеюшие эавннчиваюшнеся крышки с тефлоновыми прокладками. Спектрофотометр или колориметр и стеклянные кюветы или пробирки для колориметра. 304 тс химичискии состлв Вся стеклянная посуда должна быть тщательно вымыта и ополосиута серной кислотой. После мытья нельзя допускать попадаиия иа кее пыли и оставлять иа пей отпечатки пальцев, Методика Пробы гидролнзованного пептидогликана, содержащие от 5 до 50 мкг мурамовой кислоты, вносят в пробирки, имеющие завинчнвающиеся крышки с тефлоновыми прокладками, и нейтрализуют равным объемом 4 н.
МаОН. Готовят стандартные растворы, содержащие 1 — 10 мкг молочной кислоты в составе мурамовой кислоты, а также контрольную пробу с реактивом. Объем всех проб доводят до 1 мл дистиллированной водой. Добавляют еще 0,5 мл 1н. г1аОН и инкубируют при 37'С в течение 30 мин. Добавляют 10 мл серной кислоты, пробирки закрывают и нагревают 10 мин в кипящей воде.
После охлаждения добавляют 0,1 мл сульфата меди и 0,2 мл н-гидроксифенильного реактива и быстро перемешивают с помощью встряхивателя Ъ'ог1ех. Пробирки инкубируют в водяной бане при 30'С в течение 30 мнн, после чего измеряют оптическую плотность при 560 нм. Концентрацию мурамовой кислоты определяют по стандартной калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью в стандартных пробах и концентрацией в ннх мурамовой кислоты. Применение методики Мы привели описание простого, быстрого, не требующего дорогих реактивов и приборов способа определения мурановой кислоты в отсутствие молочной кислоты, образуемой бактериями в процессе метаболизма. Определению не мешают ни другие компоненты пептидогликана, ни уроновые кислоты и нейтральные сахара при их содержании в пробе до 250 мкг.
17.2.9. 2-Кето-3-дезоксиоктановая кислота 2-Кето-3-дезоксиоктановую кислоту 1КДО) в лнпополисахаридах определяют по методу Вейсбаха и Хурвитца [181, модифицированному Осборном '113]. При 305 ЧАСТЫЧ, МЕТАБОЛИЗМ окислении периодатом КДО дает формилпировиноградную кислоту, которая, реагируя с тиобарбитуровой кислотой, образует хромофор с максимумом оптической плотности при 550 нм. Дезоксисахара, кроме 2-кето-3- дезоксисахарных кислот, образуют различные окрашенные продукты, имеющие максимум оптической плотности при длинах волн, которые находятся вне диапазона 545 — 550 нм.
Реактивы Псриодатиый реактив: Н10, растворяют в 0,125 и. Н<50< до конпентраиии 0,025 н. Разбавленная серная кислота: 0,02 и. Нз50<. !Предостережение! См. равд. 17.2.2.) Раствор арсеннта натрия: 0,2 и. арсеннт натрия растворяют и 0,5 н. НС1. (Предостережение( Арсенит натрия ядовит. Следует избегать вдыхания порошка. После работы с реактивом необходимо хорошо вымыть руки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
