Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 61
Текст из файла (страница 61)
При работе с ним следует надевать защитные очки.) Липиды 315 ЧАСТЬ 1Н. МЕТАБОЛИЗМ видны в виде коричневых пятен при дневном свете и очень темных пятен — под УФ-лампой. Пятна обводят карандашом, до того как окраска начнет исчезать. 17.3.5.
Определение фосфата в фосфолипидах Количество фосфата в каждой фосфолипидной фракции„полученной с помощью тонкослойной хроматографии, можно определить по методике Бартлета, описанной Кейтсом 1201. Реактивы и материалы Прозрачные пирекоовые пробирки размером !ау!100 мм промывают в горячей 1 и. азотной кислоте в течение 1 ч н прополаскиваютдистиллированной водой. Вся стеклянная посуда должна быть тщательно очищена от следов моющих средств и других источников загрязнения фосфором.
(Лредостережение/ При работе с горячей азотной кислотой необходимо надевать резиновые перчатки, защитную одежду и очки. Бее операции следует выполнять под тягой.) Промытые кислотой стеклянные шарики обрабатывают вместе с пробирками, как описано выше. Хлорная кислота 72зс-ный (объем/объем) раствор в дистиллированной воде.
1Предостережение! Хлорная кислота и ее пары вызывают ожоги. При работе с ней необходимо надевать защитную одежду, перчатки и очки. Если в присутствии хлорной кислоты н окнсляющих веществ нагревать раствор до 150'С, может произойти пожар или взрыв ) Молибдат аммония: бс -ный раствор 1вес/объем) в дистиллированной воде. Амидол: 0,5 г 2,4-диамннофенолдигидрохлорида добавляют к 50 мл 20т -ного (вес/объем) бисульфита натрия и раствор фильтруют. фосфорный стандарт (10 мкг фосфора/мл): растворяют 1,097 г КНзРОз в 250 мл дистиллированной воды. Полученный раствор разбавляют 1: 1О дистиллированной водой до концентрации фосфора!О млт/мл. Методика Известное количество липидов вносят в пробирку и выпаривают растворитель в токе профильтрованного воздуха или азота при 40'С.
Фосфорные стандарты, содержащие 1 — 10 мкг фосфора в 1 мл (0,1 — 1,0 мл стан- 316 1х химический сОстАВ дартного раствора), высушива1от таким же образом. Добавляют 0,4 мл 727В-ной хлорной кислоты и закрывают пробирки промытыми кислотой стеклянными шариками.
Нагревают при 100'С до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и бесцветным, Работают в вытяжном шкафу, приспособленном для процедур с хлорной кислотой. Добавляют 4,2 мл дистиллированной воды, 0,2мл раствора молнбдата аммония и 0,2 мл амидола. Перемешивают и закрывают каждую пробирку стеклянным шариком. Пробирки нагревают 7 мин в кипящей водяной бане. Быстро охлаждают их и через 15 мин измеряют оптическую плотность при 830 нм (равд. 16.1.1). Для настройки спектрофотометра на нуль используют контрольную пробу без фосфата. Концентрацию фосфата в каждой пробе определяют по стандартной калибровочной кривой, отражающей зависимость между концентрацией фосфата в стандартных пробах и оптической плотностью в них.
Эта зависимость имеет линейный характер до концентрации фосфата 10 мкг/мл. Суммарное содержание фосфата в фосфолипидах можно выразить в микромолях каждого фосфолипида, допустив, что все они содержат по одной фосфатной группе. 17.3.6. Идентификация фосфолипидов 119, 20, 31) Фосфолипиды можно деацилировать путем слабого щелочного гидролиза, приводящего к образованию водорастворимых глицерофосфатов и жирных кислот, растворимых в органических растворителях.
Глицерофосфаты идентифицируют в специальных реакциях с образованием окрашенных продуктов по значениям Яб определенным с помощью хроматографии на бумаге 121]. Жирные кислоты лучше всего идентифицировать с помощью газожидкостной хроматографии метиловых эфиров (разд. 16.3.4). Дополнительное подтверждение результатов идентификации фосфолипидов можно получить, анализируя свободные основания, образующиеся при кислотном гидролизе.
Их определяют по значениям Я1 и результатам окрашиванпя после разделения на бумажных хроматограммах 119, 311, 317 ЧАСТЬ гч. МЕТАБОЛИЗМ Реактивы и материалы Раствор гидроксида натрия в метаноле (0,2 н.): 0,4 г )(аОН растворяют в 50 мл метанола. Используют свежеприготовленный раствор, (Предостережение! См. равд. 17.3.1.) Раствор гидроксида аммония в метаноле (1,5 н.): 10 мл концентрированного гидроксида аммония разбавляют метанолом до 100 мл.
(Предостережение! Гидроксид аммония (пары и жидкость) — едкая щелочь. Все операции при работе с нкм необходимо выполнять в вытяжном шкафу, надевая защитные перчатки, одежду и очки.) Гидроксид натрия (1,25 н.). Хлороформ, (Предостережение! См. равд, 17.3.1.) Метанол. (Предостережение! См.
равд. 17.3.1.) Катионообменная смола: В(о-)сап АО 50йгх8, дауэкс-50 (Н"), амберлнт 1!1-100 (Нт) или другие смолы подобного типа. Соляная кислота (1 н.). Водонасыщенный фенол: равные объемы дважды перегианного жидкого фенола и воды наливают в плотно закрывающуюся бутыль, встряхивают н сливают слой фенола. Водоиасыщеиный фенол хранят в склянке нз темного стекла при 4'С. Ддя каждого опыта его готовят заново нз дважды перегнаниого фенола, хранящегося при — 20'С. (Предостережение! Фенол выаывает сильные ожоги. Прн работе с ним нужно надевать защитные перчатки, одежду и очки, а перегонку необходимо проводить в вытяжном шкафу.) Смесь метанола и воды (10: 9; по объему).
Этанол абсолютный (ч. д. ал геаяеп! я!аде). Уксусная кислота ледяная (ч. д. ан геаясп! я!аде). Гексан, чистый для спектрофотометрии (Мегй апд Со., 1пс., Ва)пчау, Н. У.). Пробирки на 15 мл со стеклянными пробками. Хроматографическая бумага %0а1щап № 1; размер бумагк за висит от величины хроматографической камеры. Камера для нисходящей бумажной хроматографии. Ампулы для лиофилнзации на 10 мл. Лиофилизатор нли вакуумный нспаритель.
Стандарты фосфолипидов: фосфатидилхолии (днстеароиловый эфир), фосфатидилсерии нз бычьего мозга, фосфатидилэтаноламин из В. со!г, фосфатидил-Х,Н-диметнлэтаноламин (дипальмнтоиловый эфир), фосфатидилглицерин (кардиолипин) из бычьего сердца. Реактив Драгендорфа для опрыскивания: 1,7 г нитрата висмута растворяют в 100 мл 20тюной уксусной кислоты, 10 г иодида калия растворяют в 25 мл воды. Непосредственно перед использованием смешивают 5 мл раствора иодида калия, 20 мл раствора нитрата висмута и 70 мл воды. Эту смесь применяют для опрыскивания. Раствор нингндрнна; 0,25 г ниигидрина (ч.
д. ал геайеп! я!аде) растворяют в 100 мл смеси ацетона и лютидена (2,6-диметилпнридина; 9;1, по объему). Используют свежеприготовлеиный реактив. (Осторожно! Нингидрин может вызывать аллергическую реакцию.) 318 17 химический сОстАВ Методика Кислотный гидролиз фосфолипидов и идентификация свободных оснований. В ампулу для лиофилизации, где уже находится фракция очищенных фосфолипидов, полученная в результате разделения с помощью тонкослойной хроматографии (равд.
17.3.4), вносят 2 мл 1 н. НС1. Ампулу запаивают и нагревают при 100'С в течение 4 ч. Затем ее охлаждают и открывают. Содержимое ампулы переносят в 10-мл пробирку с завинчивающейся пробкой и добавляют к нему 2 мл дважды перегнанпого гексана. Перемешивают с помощью встряхивателя Чог1ех и оставляют на некоторое время для разделения фаз. Удаляют водный слой и лиофилизу1от или высушивают его в испарителе. Остаток растворяют в 0,1 мл дистиллированной воды. На хроматографическую бумагу %па1шап №1 наносят отдельно каждую пробу в виде пятна диаметром 10 мм и проводят фракционирование методом нисходящей хроматографии, используя систему растворителей фенол †этанол †уксу кислота (50:5: 6; по объему). В качестве стандартов для хроматографирования и идентификации свободных оснований используют аналогично обработанные известные фосфолнпнды или холин, этаноламин, серии и И,И-диметилзтаноламин !191.
После пропускания растворителя хроматограмму сушат в течение ночи в вытяжном шкафу и затем разрезают на полоски. Одну полоску, содержащую стандарт или неизвестное вещество, опрыскивают нингидрином, а другую (с тем же неизвестным веществом или стандартом) — реактивом Драгендорфа. Серии и этаноламин после обработки нингидрином проявляются в виде синих пятен с значениями 1(г около 0,27 и 0,51 соответственно.
Холин и 5(,!4-днметилэтаноламин не реагируют с нннгидрином. Реактив Драгендорфа окрашивает холин в оранжевый цвет, а диметилзтаноламин — в бледно-оранжевый. Значения Яг для холина и Ы,5(-диметилэтаноламина составляют 0,93 и 0,86 соответственно. Щелочной гидролиз фосфолипидов и определение глицерофосфатов 119, 201. К 1 — 5 мг фосфолипндов, полученных хроматографией на флорисиле (равд. 17.3.3), добавляют 0,2 мл хлороформа, 0,3 мл метанола и 0,5 мл 319 ЧАСТЬ ЦС МЕТАБОЛИЗМ метанольного раствора гидроксида натрия. Смесь перемешивают в пробирке со стеклянной пробкой с помощью встряхивателя чог1ех и оставляют при комнатной температуре на 15 мин.
Добавляют 1,9 мл смеси хлороформ — метанол— 1,25 н. ХаОН (1: 4: 4,5; по объему), переносят в коническую центрифужную пробирку, перемешивают смесь с помощью встряхивателя ттог1ех и центрифугпруют 1 мин при 600 и. Верхний слой метанольно-водного слоя удаляют пастеровской пипеткой. Добавляют к нему катионообменную смолу, энергично встряхивая до тех пор, пока рН, измеренный с помощью индикаторной бумаги, не станет равным 5 — 6. Пробу центрифугируют и отделяют жидкость от смолы с помощью пастеровской пипетки. Добавляют 1 — 2 капли метанольного раствора гидроксида аммония для того, чтобы раствор стал слегка щелочным (рН 7,5 — 9,0). рН определяют с помощью индикаторной бумаги.
Жидкость выпаривают досуха в токе азота при 30'С и остаток растворяют в 0,1 мл смеси метанола н воды (10: 9; по объему). Растворенные глицерофосфаты идентифицируют совместной хроматографией с продуктами, образующимися после аналогичной обработки известных фосфолипидов [191. Для этого три аликвоты каждой пробы по 25 мкл каждая наносят на бумагу )Ат)та(шап № 1 на расстоянии 10 см друг от друга и ставят нисходящую хроматограмму в системе фенол — этанол — уксусная кислота (50: 5: 6).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
