Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 63
Текст из файла (страница 63)
Пептидоглнкан большинства бактерий имеет основную цепь. состоящую из чередующихся остатков Н-ацетилглюкозаамина и Н-ацетилмурамовой кислоты, связанных ~3 (1 — +-4) -гликозидными связями. Небольшие отклонения от этой структуры наблюдаются у некоторых видов 51гер1отусез 1'38), у которых имеется И-гликоилмурамовая кислота. В кортексе эндоспор бактерий найден модифицированный пептидогликан, содержащий мурамиловый лактам ~55). Тетрапептид присоединяется к карбоксильной группе 3-О-О-молочной кислоты, связанной с остатками Н-ацетилмурамовой кислоты. Порядок расположения аминокислот в тетрапептиде чагпе всего следующий: Е-алании, О-глутаминовая кислота, диаминовая кислота и концевой О-алании. К диаминовым кислотам в составе тетрапептида относятся лево- и Е1-диаминопимелиновая кислота, Е-лизин, Е-орнитин и 1.-диаминомасляная кислота.
Эти и некоторые другие отклонении в структуре тетрапептида рассматриваются в работах Гуйзена 1401, Роджерса и др. 1451 и Камминса 138). Тетрапептидные цепи поперечно связаны друг с другом. Количество и природа поперечных связей у различных организмов различны. Это может быть прямая пептидная связь между двухосновной аминокислотой в одном тетрапептиде и Э-аланином другого тетрапептида 325 ЧАСТЫЧ. МЕТАБОЛИЗМ или соединение двух тетрапептидов посредством одной или нескольких аминокислот ~36, 38, 45, 48~. Наличие Н-ацетилмурамовой кислоты только в пептидогликапе позволяет определять присутствие этого полимера в бактериальных клетках, а также проводить количественный анализ микробной биомассы в пробах почвы и воды.
Диамивопимелиновая кислота обнаружена в макромолекулах только как компонент пептидогликана, поэтому положительные пробы на это соединение означают присутствие пептидогликана. Однако не все пептидогликаны содержат эту диаминокислоту,~38~, Клеточные стенки грамположительных бактерий часто содержат также тейхоевые и тейхуроновые кислоты, белки и липотейхоевые кислоты. Тейхоевые кислоты— это сложные полимеры полиолов (рибита н глицерина), связанные в основной цепи фосфодиэфирными связями. Описаны некоторые отклонения в структуре основной цепи этих полимеров ~38, 47~.
Тейхоевые кислоты составляют 50% клеточной стенки некоторых грамположительных бактерий. Они являются хорошими антигепами, их серологическая реактивность используется для определения антигенных групп некоторых родов бактерий ~47~. Тейхоевые кислоты клеточных стенок ковалентно связаны с пептидогликаном. Тейхоевые кислоты типа полимерных глицерофосфатов, называемые липотейхоевыми кислотами, ковалентно связаны с гликолипидами. Они обнаружены в плазматической мембране после разрушения клеток. Наиболее распространенные антигепиые детерминанты — это сахара или амипосахара, присоединенные через гидроксильные группы к полиолам основной цепи. Часто бывает связан с полиолами алании.
Тейхуроновые кислоты представляют собой кислые полисахариды, которые содержат уроновые кислоты, но не содержат фосфаты. Полимеры глюкуроновой кислоты с Х-ацетилглюкозамином и полимеры аминоманнуроновой кислоты с глюкозой встречаются у Васйиз Дспет'- ~огти и Мкгосассиз !раог7еййсиз соответственно. Другие полимеры уроновой кислоты были обнаружены в качестве компонентов клеточной стенки у ряда грамположительных бактерий [38~.
Полисахариды клеточной стенки и липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий, в частности 326 17, химичаский сОсТАВ стрептококков, определяют антигенные различия, позволяющие разделять эти бактерии на серологические группы [38~, Полисахариды клеточных стенок других грамположительных бактерий образуют неоднородную группу макромолекул, состоящую обычно из нейтральных сахаров и иногда аминосахаров. Эти полисахариды имеют значение при дифференциации штаммов и видов, особенно в случае присутствия необычных или редко встречающихся сахаров. Белки широко распространены как компоненты клеточной стенки грамположительных бактерий.
Поверхностные антигены стрептококков содержат различные кислоторастворимые белки [381. Клеточные стенки у грамотрицатсльных бактерий намного сложнее, чем у грамположительных. Содержание пептидогликана в них значительно ниже, а у энтеробактернй пептидогликан ковалентно связан с липопротеинами, которые, вероятно, образуют связь между пептидогликаном и наружной мембраной клеточной стенки. Наружный мембранный слой богат липополисахаридами. Липополисахариды — это чрезвычайно сложные молекулы с мол.
массой выше 10000 [35, 36, 39, 41, 44, 54, 571. Липополисахариды Яа1топе11а эрр. состоят из трех частей: липидной, полисахаридного остова и О-полисахарнда. Липидная часть, которую называют липидом А, содержит фосфорилированный дисахарид глюкозамнн„ сильно этсрифицированный по гидроксильным и аминогруппам жирными кислотами с 10 — 22 углеродными атомами в цепи.
Основной жирнокислотный компонент фракции липида А — 8-гндроксимиристиновая кислота, присущая только липндной части молекулы лнпополисахарида. Полисахарндный остов связывает липид А и О-полисахарид. Он состоит из четырех основных сахаров, 2-кето-3-дезоксиоктановой кислоты, фосфата и этаночамина, 2-Кето-3-дсзоксиоктановая кислота присутствует только в этой части молекулы липополисахарида. Полисахаридный остов БаЬполе11а ТурИтигшт содержит следующие сахара: глюкозу, галактозу, гептозу н глюкозамнн,[35, 571. Он ковалентно связан вторым углеродным атомом 2-кето-3-дезоксиоктановой кислоты 327 часть пл матлволнзм со вторым углеродным атомом глюкозаминового остатка лнпида А.
Г1олнсахарндный остов ковалентно связан также с варнабельнымн О-полнсахариднымн цспямн. Несколько полпсахарпдных субъеднниц могут быть связаны друг с другом пирофосфатнымн связями в липидной части молекулы. Липид А встроен в наружную мембрану таким образом, что О-полисахариды выступают наружу ~[35, 361. О-Полисахариды являются главными антигенными детерминантами (О-антигеном) поверхности грамотрнцательных бактерий. Они часто служат рецепторами для бактернофагов.
Тонкая структура н состав наружной мембраны грамотрицательных бактерий позволяют предполагать, что она представляет собой двойной слой, содержащий фосфолипиды и белки с различными количествами липополисахарида. Наружная мембрана ограничивает периплазматнческое пространство — содержащий ферменты компартмент, связанный плазматической мембраной с внутренней частью клетки [35, 36~. Некоторые грамотрнцательные клетки имеют наружную белковую илн толстую полисахаридную оболочку, которая расположена снаружи от липополисахарндной зоны, выступающей из наружной мембраны [35, 361.
Было бы нецелесообразно описывать здесь все методы выделения и определения характеристик структурных компонентов клеточных стенок. Выбор метода зависит от исследуемого организма, имеющихся возможностей и целей исследования. Для одних исследований не требуются интактные высокоочищенные полимеры, для других, наоборот, необходимы и нативпые, и чистые макромолекулярные вещества, Тот, кто хочет всесторонне охарактеризовать один из рассмотренных здесь полимеров бактерий, прежде всего должен ознакомиться с литературой, в которой описаны различные методы выделения, а также преимущества и ограничения каждого нз них [35, 36, 57, 58~.
Здесь даны самые простые методы выделения и получения предварительных характеристик пептидогликанов и липополисахаридов из наиболее распространенных в лабораторных исследованиях бактерий. 328 17. ХИМНЧЕСКИН СОСТАВ 17.4.1. Пептидогликаны Реактивы и оборудование Физиологический раствор: 0,9уз-пый (вссггобъсм) раствор )ЧзС! в дистиллированной воде Фсрмеятяый препарат: кристаллический тряпспя Тряс-буфер: 1,21 г гриса растворяют в 90 мл дистиллированной воды. Доводят рН до 7 с помощью 5 н.
НС! и разбавляют водой до 100 мл Дсзокспрябояуклсззз; 5 мг сухого порошка фермента растворяют в 1,0 мл тряс-буфера Рпбояуклеззя: 5 мг сухого порошка фермента растворяют в 1 мл тряс-буфера Цсятряфугз с охлаждением (максимальная скорость 22 000 К) Толстостенные стеклянные (пярсхсовые) цеятряфужяые пробирка яз 50 мл Ценгряфужпые стаканы (100 — 250 мл) я соответствующие роторы. (Предостережеяие) Тоякостеппыс пярсксовыс стеклянные пробирки яе выдерживают скорости 22 000 я ) Ультразвуковой дезяптегрзтор, пресс Френча вля механическая мельница Методика Бактернальные клетки охлаждают в ростовой среде до 4'С льдом и собирают центрнфугированием в 100— 250-мл стаканах (5000 д, !5 мин). Клетки ресуспендируют в 20 мл охлажденного физиологического раствора и снова центрифугируют. Осажденные клетки используют сразу же нлн лиофилизуют их и хранят в морозильнике для предотвращения автолнза.
Готовят однородную суспензию клеток в 20 мл холодной воды. Лнофилизованные клетки суспендируют в несколько этапов: сначала делают густую кашицу из клеток, медленно добавляя воду и постоянно помешивая образующуюся суспензию. Клетки перемешивают механическим способом или с помощью ручного гомогенизатора до полного днспергировання. При отсутствии механического гомогенизатора можно сделать то жс самое путем всасывання и выдувания суспензин через пипетку с ватным тампоном.
Суспензию хранят на холоду для предотвращения авто- лиза клеточных стенок в течение всех процедур. Клетки разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора, механической мельницы нли пресса Френча (равд. 5.1). Сразу же после разрушения с спснзню 329 чхстыч метлволизм клеток нагревают до 75'С. Эту температуру поддерживают в течение 15 мин для инактивации автолитическнх ферментов. Неразрушенные клетки удаляют центрифугированием при низкой скорости (1000 д, 15 мин), Осадок отбрасывают, а надосадочную фракцию центрифугируют в 30-мл центрифужных пробирках при 22000 д в течение 15 мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
