Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 66
Текст из файла (страница 66)
17.5.3. Другие методы определения ДНК н РНК Чистые растворы ДНК или РНК, не содержащие белков и углеводов, можно анализировать методом УФ-спектроскопии (равд. 22.4.1). Раствор, содержащий 1 мг чистой нуклеиновой кислоты в 1 мл, имеет оптическую плотность при 260 нм -22 — 23. Помимо колориметрического анализа ДНК в клетках и тканях существует еще один быстрый и чувствительный способ, описанный Цаном [63). Он основан на определении тимина в гидролизатах клеток с помощью газовой хроматографии. Недостаток этого способа в том, что он требует наличия газового хроматографа.
Если измерения ДНК проводят ежедневно, то применение газового хроматографа в этом случае оправданно из-за экономии времени. Применение методики Описанная выше методика позволяет выделять около 95% нуклеиновых кислот из бактериальных клеток и эндоспор. Если же с ее помощью не удается полностью экстрагировать нуклеиновые кислоты, о чем можно судить по наличию ДНК в растворимой фракции после третьей экстракции осадка, то в этом случае применяют другой способ экстракции.
Он заключается в обработке клеток 5%-ной (вес/объем) ТХУ с нагреванием в течение 15 мин прн 90'С. Экстракт разбавляют до требуемого объема 5%-ным трихлорацетатом и анализируют по описанной выше методике. Если нужно определить концентрацию очищенной ДНК в растворе, пробы обрабатывают один раз 0,5 н. НС104 при 70'С в течение 15 мин. Пробы с обрабо- ЧАСТЬ НЛ МЕТАБОЛИЗМ таиной ДНК анализируют по реакции с днфениламином, как описано выше. При низких концентрациях ДНК осаждение нуклепновой кислоты охлажденной хлорной кислотой приводит к относительно большим потерям.
Поэтому в случае чистых растворов ДНК этот этап проводить не следует. При необходимости осаждения ДНК из разбавленных растворов с целью ее отделения от мешающих определению веществ, например нуклеотидов, в каждую пробирку можно добавить 100 мкг бычьего сывороточного альбумина в качестве соосадителя. Этот прием способствует лучшему осаждению ДНК. Колориметрия и УФ-спектрофотометрия применимы в случае любых РНК.
Все РНК имеют одинаковый коэффициент экстннкцнн при колориметрнческом определении. В присутствии белков, полисахаридов и многих других веществ, поглощающих УФ-свет (в том числе фенола, который часто применяется при выделении нуклеиновых кислот), точность УФ-спектрофотометрического анализа снижается. Отклонения от нормального спектра свидетельствуют о загрязнении белком, углеводом или другими соединениями.
При определении РНК с орцином анализу мешают гексозы, дающие коричневую окраску. Поэтому определение количества РНК в сахарозных градиентах или в растворах, содержащих гексозы или их полимеры, лучше всего проводить с помощью УФ-спектрометрии. Преимуществом УФ-спектрометрии является то, что при ее применении не происходит разрушения вещества, а это существенно при наличии небольших количеств нуклеиновых кислот. Важно также и то, что она проста н удобна на практике.
Если известно количество клеток в единице объема, можно рассчитать количество ДНК на клетку по содержанию ДНК в суспензии и на основе этих данных— размер генома бактерии 1591. 17,6. АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ СОЕДИНЕНИЯ Выбор наиболее подходящего метода анализа азота в каком-либо соединении зависит от вида анализируемого азота, его концентрации и наличия мешающих оп- зто 1Т. ХиМический сОстАВ ределению веществ. Наиболее распространенный способ определения нитритного азота включает модификацию диазотирования н связанных с ннм реакций.
Для определения нитратного, аммонийного, а также органического азота применяют другие методы. В табл, 17.1 сравнивается чувствительность некоторых методов и указаны случаи их применения. Ниже мы опишем наиболее простые и вместе с тем широко применяемые методы анализа азота в различных содержащих его соединениях. Ссылки на литературу, содержащую описание других методов, приведены в табл.
17.1. Ввиду разнообразия веществ, которые можно проверять на содержание азота (например, молоко, удобрения, почва, материалы растительного и животного происхождения), многие методы, персчислснныс в табл. 17.1, приходится модифицировать нли жс необходимо проводить предварительную обработку пробы, так чтобы ее можно было использовать в условиях анализа, Описано много нариантов методик, приведенных здесь полностью или только перечисленных; поэтому, обратившись к литературе, можно выбрать метод, подходящий для данного образца.
17.6.1. Нитрит (см. также равд. 16.2.2) Анализ нитритного азота основан на реакции НОА с сульфаниламидом в кислой среде с образованием диазосоединения. Последнее реагирует с )4-(1-нафтил)- этилендиамипом, образуя краситель, поглощающий свет при 543 нм 173, 801, Указанные реактивы можно заменить сульфаннловой кислотой и а-нафтиламином, однако последний признан канцерогеном и должен применяться под строгим контролем.
С помощью этой реакции можно определять до 1 мкг/л ХОз- при толщине кюветы 10 см. Поглощение окрашенного соединения подчиняется закону Ламберта — Бэра (разд. 16.1.1) до концентрации НОА 180 мкг/л (68). Ионы, вызывающие осаждение ХО1 и, следовательно, мешающие определению, перечислены в табл. 17.1.
В их присутствии необходимо применять другой метод обнаружения ИОэ-, например его восстановление и последующий анализ ЫН4+. Как и при любом Таблица 17.1. Сравнение аналитических методов определения азота Источник данныи Основные недостатки Простота ! мкг/л (64, 68, 73, 80, 92] ,с ю о' ш р О3 сз й 61, 62, 8, 70! >2 мг/л (97, 104! ЫОз Соединени» азота Аналитическая метод Диазотирова- нне Восстановление до ЫНае горячей шелочью или салициловой кислотой с последу юшим анализом ХНа' Другие методы' Восстановление до КОт с последуюшим впали. зом на ХОт —" Минимальные количества азота Вещества, мешающие олре- делению С1-, окрашенные вещества, взвешенные частицы, ионы БЬ, Вй Ре(1111, РЬ, Ни, Аи, соли' Сц' (!И), Ан, хлорплатииат, мета- ваиадат Ноз, Ынее Основные достоинства Удобно при (ХОт(> >2000 мкг/л Мешает при.
сутствие С1- и Гееь Применение горячей щелочи, не. обходимость перегонки, образование ЫОт — + +ЫО -+(т(Н + )73) То же То же [88! )81, 92) 40 мкг/л )88) )581 Восстановление Сй — Сн Восстановление Сд — Нд Восстановление Еп Измерение оптической плотности при 220 им Метод с исполь зеванием бру- цина Восстаиовленне до 95% Восстановление ъ95% !00 мкг/л )Ь'-]>2 мг/л может активнровать ко- лонки Многие органические соединения, НОт-, ПАВ, хромат'-, окрашенные вещества Окрашенные вещества, взвешенные частицы, сильные окислители, сильные восстанови- тели, НОз, органические вещества в высокой концентрации, С1-, попы ге, Мпт ..
Быстрое восстановление при наличии приготовленной колонки То же Не требуется приготовления колонки Простота Приготовление ко- ловки Приготовление колонки, использование На Большее время восстановления Необходимость УФ-спектрофо. тометра, помехи за счет многих органических со- единений Бруцин — высокотокснчный алкалоид (его необходимо взвеши. вать в вытяжном шкафу); низкая чувствительиостги помехи за счет окислителей и вес.
становителей ы х ш ,с гт ж ш Я ш о ш ч Ю Вешества. мешающие оире- Дслеин4О Минимальные количества ааота Источник данник Соедине44не еватв Основные недостатки Основные дос воинства [68! 100 мкг/л Л О ы о ~64, 65, 20 мкг/л ы от О ы ш Р1от— 1644 бз, 68, 84! ь102, ХН + >2 мгт4л Аналитнческна метод Метод с исполь. зовакием хромотроповой кнс.четы Нитрофенолднсульфоно. вый метод Восстаиовлс. ние до гчнее горячей щелочью или салипилоной кислотой с последующим анализом .4 Н4 Окрашенные вещества, взвешенные частицы, Ва, РЬЬ Бг, иодид, иодат, селеннтт селенат, хро. мат Органические вещества, С1- Окраска устойчива в течение 24 ч Простой и иря мой метод Удобно, когда азота н ГсОт>2 мг!и Продолжение табл. 1У.1. Нязкая чувстви- тельность Необходимость сушки, помехи за счет органических соединений Для приготовления реагентовнеобходимо кипячение НтВО4 Использование горячей щелочи, необходимость перегонки, образование ЫОт + 41ЧОт чек'Н -' [70, 75, 76, 84, 103', !04) [73) 10 мкг/л 20 мкг/л другие методые Окисление" до НОз с последующим анализом ХОхИспользоваиие индофенолового синего (известного также как феиат) Применение раствора Нес- слера Аминокислоты, атмосферный ХНз Взвешенные частицы, окрашенные вещества, избыток кислоты или щелочи, соединения азота с низкой молекулярной массой Взвешенные частицы, окрашенные вещества, иояы Ми, Ге, Са.
5, Мп, С1, низкомолекуляряые органические со. единения Не требуется перегонки Простота; наиболее предпочтительный колоричетрический метод после метода Кьельдаля Удобно для растворов образцов в чистой воде Выделение ХОг из некоторых аминокислот Может потребоватьсн предварительная пере- гонка; применение фенола; неустойчивость ре- активов Может потребоваться предварительная перегонка; применение Нй [64, 68, 89) ш ж з [64, 68) Продолжение табл. 17,1.
Минимальные количества азота Вещества, мещающке опре- делению Соединение азота Основные достоинства Источник данных Основные недостатки С1- 2 мкг/л [64, 68, 70] 50 мкг/л Суммарвыв органяческяй азот Аналитическая метод Ациднметряче. ский метод Пнридин-пиразоловый спо- соб Метод Кьельдаля с последуюпгям анализом на ХНь+ или окисление до (ь)От- и анализ иа Р(От— Ионы ге, Еп, Ай, Со, циа- нат ХНье (опреде. ляют отдельно и выпита. ют нля Отгоняют) После агапа перегонки методика проста; удобна прн высоком содержании ИН,; наиболее предпочтительный метод после метода Кьель- даля Специфичен для р(На е Количественное опреде- ление Необходимость пе- регонки Использование пи- ридииа Использоваяие Нй (см.
работы, указанные в ссылках), необходимость перегонки, образование паров НтБОь с (73, 88) О ~64, 65, К 68, 70, 71, 78, 79, 98) [67, 82, 91) 30 мг/л )67, 70, 89) 1 г/л Быстрота х й )86, 87, ш 89, 105) И )78, 95, и УФ-Спектро- фотометрия 1О мг/л Простота 30 мг/л Детергенты 5 мкг/л )77, 94) Азот белка Метод Лоури Бнуретовый ме. тод Связывание с красителем Флуорнметрический анализ Аминокислотный или пептидный буфер, меркаптаны.
(НН,) з50, Аминокнслотный нли пептндный буфер Нуклеиновые кислоты, фенольные соо единения Аминокислотиый илн пептидный бу- фер Высокая чувст внтельность Реакция не так снльяо зависит от состава белка, как в методе Лаури; быстрота Быстрота, высокая чувствительность, небольшой объем пробы, удобен для очищенных белков Результаты варьируют в зависимости от аминокислотного состава; не подчиняется закону Ламберта — Бара Низкая точность или чувствительность; результаты варьируют в зависимости от амияокислотного состава Необходимость УФ-спектрофотометра; помехи за счет нуклеиновых кислот Использование фосфорной кис- лоты Результаты варьируют в зависимости от аминокислотного состава; использование диоксана Продолжение табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
