Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 68
Текст из файла (страница 68)
Гипохлоритный реактив: смешивают 10 мл имеющейся в прадаже хлорной извести (бчьчгый раствор гипохлорита) н 40 мл дистиллированной воды, очищенной от ионов ННгг. рН донодят до 6,5 — 7. Каждую неделю готовят свежий раствов. Фенолятный реактив: 2,5 г ХаОН и 10 г фенола растворяют в 100 мл дистиллированной авды, очищенной от )чНг+. Еженедельно готовят свежий раствор. (Осторожно! Фенол быстро проникает через кожу и вызывает сильные ожоги.
Твердый фенол взвешивают в перчатках, фартуке и защитных очках. Работают в вытяжном шкафу, избегая вдыхания паров, Нельзя насасывать фенол в пипетку ртом.) Стандартные растворы ХН,ч. Готовят основной раствор МН,+, растворяя 381,9 мг безводного ХНчС! (высушенвого при 100'С) в воде, не содержащей )ЧН,+, и доводят объем до 1 л. 1 мл такого раствора содержит 100 мкг азота н 122 мкг ННь Стандарты получают разбавлением основного раствора до концентраций от 0,1 до 5 мкг аммонийного азота на 10 мл. Методика В небольшой химический стакан нли колбу помещают 10 мл пробы и 0,05 мл (1 каплю) раствора Мп504. При постоянном перемешиванни (для этого лучше всего пользоваться магнитной мешалкой) добавляют 0,5 мл гипохлоритного реактива. Затем сразу же добавляют по каплям 0,6 мл фенолятного реактива.
Реакция протекает 10 мин с образованием устойчивой в течение 24 ч окраски. Интенсивность окраски измеряют с помощью колориметра нли спектрофотометра при 630 нм. Контрольную пробу и калибровочную кривую готовят ежедневно, так как при хранении реактивов интенсивность окраски может меняться. 17. ХИМИЧЕСКИИ СОСТАВ 17.6.4. Определение аммония методом Несслера Пробы Пробы обрабатывают, как описано в разд. 17.6.1. При большом содержании мешающих определеии10 веществ (табл. 17.1) может потребоваться предварительная перегоика реактивов 1681.
Реактивы Вода, не содержащая аммония. Готовят, как описано в равд. 1 7.6.3. Реактивы для удаления болшпнх количеств мешающих определению катионов: 100 г Еп504 7Н,О растворяют в воде, не содержащей аммония, и доводят объем до 1 л. 6 и. ХаОН готовят растворением 240 г ХаОН в воде, не содержащей аммония н доводят объем до! л. Реактив для удаления следавых количеств мешающих определению катионов.
50 г Хаз-ЭДТД растворяют в 60 мл воды, очищенной от аммония, но содержащей 10 г ХаОН. (Для растворения реактивов может потребоваться нагреванне.) Охлажденный раствор разбавляют до !00 мл водой, не содержащей аммония. Реактив Несслера. 100 г Ня!з и 70 г К! смешивают в минимальном калнчестве воды (100 — 200 мл). Эту смесь медленно с перемешиванием добавляют к 500 мл 8 н.
ХаОН (20 — 25 С), Доводят объем до 1 л и хранят в стеклянной посуде с резиновой пробкой в темном месте. Реактив устойчив в течение гада. (Осторожно! Реактив Несслера токсичен. Нельзя насасывать его в пипетку ртом или допускать его разбрызгивание. Остатки необходимо ликвидировать с соблюдением соответствующих для ртутных препаратов предосторожностей.) Реактив проверяют ежемесячно, сравнивая стандартную кривую для аммонийного азота оо стандартной кривой, полученной со свежим реактивам. При появлении зяачителькых отклонений в калибровочной кривой старый реактив ликвидируют. Стандартные растворы ХН,+. Готовят основной раствор ХН,-г, как описано в равд. 17.6.3, и разбавляют его для получения раство.
ров с конпентрациями от 20 до 500 мкг/50 мл. Методика Мешающие определению )ь(Н,+ ионы Са, Мд, 5 и Ге удаляют двумя способами. При высоком содержании этих ионов к 100 мл пробы добавляют 1 мл раствора УИ50ь Измеряют иа рН-метре рН н доводят его до 10,5, добавляя 0,4 — 0,5 мл 6 н. ХаОН. Мешающие определению ионы осаждаются в течение 15 мин. Осадок обычно содержит и другие суспендированные вещества. Его 355 чАсть пл мнгхаолизм удаляют фильтрованием через бумагу, пе содержащую МН,+, или центрифугироваиием. Если показано, что в пробе содержатся лишь следовые количества мешающих определению ХН~+ ионов, к 50 мл пробы добавляют 0,05 мл (1 каплю) раствора ЭДТА, тщательно перемешивая. Пробы, предварительно обработанные Еп50а и щелочью, часто обрабатывают также ЭДТА Образцы, не содержащие мешающих определению ХН,+ катионов, можно анализировать с помощью реактива Несслера без предварительной обработки. Для осугцествления реакции к 50 мл пробы добавляют 1 мл реактива Несслера.
Для пробы, обработанной ЭДТА, берут 2 мл реактива Несслера. Смесь хорошо геремешивают и оставляют при комнатной температуре, по крайней мере на 1О мин. (При низком содержании МН„+ лучше оставить на ЗО мин.) Все пробы обрабатывают в строго одинаковых условиях, в том числе стандартные и коитрольныс. Оптическую плотность образовавшегося окрашенного соединения измеряют при длине волны между 400 и 425 нм для проб и стандартов с низким содержанием ХН~+ (20 — 250 мкг/50 мл) и между 450 и 500 им пои высокой концентрации МН,+ (250— 500 мкг/50 мл).
При необходимости реакцию можно проводить с пропорционально меньшими количествами пробы, стандартных растворов и реактивов. Чувствительность определения МН„+ можно повысить до 5 мкг/50 мл, если использовать кюветч толщиной 5 см. Количество аммиака в каждой пробе определяют по калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью каждого стандарта и концентрацией аммиака в стандартном растворе (разд.
10.1.1). 17.6.5. Определение белка с помощью реактива Фолина Наиболее распространенным колориметрическим способом определения белков является метод Лоури и др. 190) с использованием реактива Фолнна. В реакции с этим реактивом получают синее окрашиванне в результате взаимодействия белка с ионом меди в щелочном растворе (биуретовая реакция) и восстановления фос- !т. химическии сОстАВ фомолибдат-фосфовольфрамовой кислоты в составе реактива гролина ароматическими аминокислотами анализируемого белка.
Описываемая ниже методика применима как к белкам, уже находящимся в растворе, так и к белкам, растворимым в разбавленных щелочах. Реактиве! Реактив А: хо г МарСО, растворяют в 1 л 0,1 н. МаОН. Реактив Б: 05 г Сп50,.5П,О растворяют в 100 мл 1с(з-ного (вес/объем) водного раствора тартрата натрия.
Реактив В: непосредственно перед использованием смешивают 50 мл реактива А н 1 мл реактива Б, раствор хранят не более од. ного дня, затем готовят новый. Реактив Г: разбавленный реактив Фолнна. Концентрярованный реактив Фолнна — Чнокальто, поставляемый несколькими фирмами (напрнмер, и!зЬег Бс!епийс Со., РНМЬпгд, Ра.), разбавляют согласно приложенной инструкции.
(Предостереясенпе! Этот реактив содержит сильную летучую кислоту, его нельзя насасывать в пипетку ртом. Прв работе необходимо надевать защитные перчаткн, одежду н очки, особенно прн использовании встряхнвателя Чог!ех.) Стандартный раствор белка, Пригодны любые имеющиеся в продаже препараты белков нлн станлартные растворы. Крнсталлнческкй бычий сывороточный альбумнн нлн растворы бычьего сывороточного альбумнна, приобретенные у фнрм, дают вполне приемлемые калнбровочные кривые.
Основной стандартный раствор должен содержать 0,5 мг белка на 1 мл дистиллированной воды. С различными белками получают различные калнбравочныс кривые. Прн опублнкованнн результатов следует указывать, какой стандарт белка вспользовался в работе. Методика Пробы, содержащие 50 — 250 мкг белка (в объеме до 1 мл) вносят в пробирки.
Объем каждой пробы доводят до 1,0 мл дистиллированной водой. Добавляют по 5,0 мл реактива В и хорошо перемешивают, Смесь оставляют, по крайней мере, на 10 мин, при комнатной температуре. Добавляют 0,5 мл реактива Г и сразу же перемешивают. Реактивность этого реагента к добавленному белку сохраняется всего несколько секунд после разбавления. Пробы оставлягот при комнатной температуре в течение ЗО мин или более и измеряют оптическую плотность при 500 пм с помощью спектрофотометра или колориметра.
Метод обладает большей чувст- ЧАСТЬ !Н. МЕТАБОЛИЗМ вительностью, если измерять оптическу1о плотность при 750 нм в соответствующем спектрофотометре. Если есть кювета на 1 мл и соответствующий прибор, все объемы можно уменьшить в 5 раз, сохранив тем самым часть реактивов н пробы. Объем проб и стандартных растворов может быть 0,2 мл, а реактивов В и Г, добавляемых через указанные промежутки времени, — 1,0 и 0,1 мл соответственно. Когда определяют белок в клетках бактерий или анализируют белки, не растворимые в разбавленной щелочи, необходимо нагревать суспензию при 90'С в 1 н. 1чаОН в течение 10 мин для полной солюбилизации. Стандартный раствор обрабатывают подобным образом, так как в результате такой обработки снижается интенсивность окраски.
В случае применения этой процедуры для растворения илн экстракцин белков реактив А заменяют реактивом, содержащим 20 г ХаСОЕ в 1 л воды. В остальном методика остается той же. Сульфат аммония в концентрации свыше 0,15% мешает развитию окраски. Об этом следует помнить, применяя эту методику к белкам, очищенным путем фракционирования, основанного на их различной растворимости в растворах сульфата аммония. Определению могут мешать и многие другис соли, некоторые сахара, глнцин, трис-буфер, некоторые хелатирующне агенты н соединения с сульфгидрильными группами, если они присутствуют в больших концентрациях (1 — 5 М). Развитию окраски мешают также ароматические аминокислоты, дающие окрашенный продукт в реакции с фенольным реактивом, и глицин, Модификация метода Лоури, делающая его пригодным для измерения белка в пробах, содержащих саха- розу или ЭДТА, а также в препаратах мембран и липопротеинов, описана Марквелломндр.
[911. Эта методика основана на применении детергента (додецилсульфата натрия, ДСН) в составе щелочного карбонатного реактива для увеличения солюбилизации лнпоидных веществ и на использовании повышенного количества тартрата меди для предотвращения помех за счет саха- розы и ЭДТА. Методика применима в нескольких случаях, в том числе при определении белков во фракциях из сахарозных градиентов. 358 !т, химический сОстАВ 17.6.6. Определение белка с помощью биуретовой реакции 168, 82~ Благодаря присутствию псптидпых связей в щелочных растворах белка образуются окрашенные в синий цвет хелаты с ионами меди. Эта реакция гораздо менее чувствительна, чем метод Лаури, однако она занимает меньше времени и может протекать в присутствии солей аммония и других веществ, мешаюгцих определени|о белка по методике Лоури.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
