Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 72
Текст из файла (страница 72)
18.2). С помощью ферментов можно изучать различные процессы регуляции, связанные с изменениями их активности: в равд. 18,3 рассматриваются эти процессы в целом, а также два основных типа регуляции — аллосгерический и путем ковалентной модификации. Присутствие и отсутствие тех или иных ферментов у определенной бактерии зависит, разумеется, от ее генотипа. Но даже если у бактерии имеются определенные гены, их транскрипция и трансляция с образованием соответствующих молекул фермента могут и не происходить. Здесь следует учитывать факторы, участвующие в регуляции генетической экспрессии и, следовательно, синтеза ферментов, рассмотренные в разд.
18.4. И наконец, поскольку ферментативные реакции редко протекают в бактериальных клетках как изолированные процессы и чаще всего являются частью сложной сети метаболических путей и циклов с взаимозависимыми этапами, мы сочли нужным рассмотреть здесь некоторые общие и специальные методы анализа путей метаболизма (разд. 18.5) .
В настоящее время существует много различных методов изучения метаболизма бактерий, рассмотрение которых следовало бы включить в эту главу. Здесь было бы полезно, например, обсудить методы, применяемые для идентификации и количественного определения различных ферментов дыхагельной цепи, участвующих в образовании взаимосвязанных путей, через которые идет поток электронов и образуются хемиосмотические градиенты. Интересно было бы рассмотреть также общие методы анализа специфических катаболических и анаболических процессов. К сожалению, объем данной книги не позволяет включить описание этих и многих других методов. В данной главе используются следующие общепринятые сокращения: сАМР— циклический аденозин-3',5'- монофосфат; АМР, АЭР и АТР— аденозинмоно-, аденозинди- и аденозинтрифосфат соответственно; Ф-6-Р— 375 чхстыч мвтхволнзм фруктозо-6-фосфат; ФДФ вЂ” фруктозо-1,6-дифосфат; Г-6-Р— глюкозо-6-фосфат; ООР и ОТР— гуанозиндии гуанозинтрнфосфат соответственно; ЭДТА — этиленднаминтетраацетат; МАО и АРАОН вЂ” окисленный и восстановленный ннкотннамидадеп1шдинуклеотид соответственно; МАОРИ вЂ” восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат; трис — трис- (гидроксиметил)- аминометан.
18.1. ПОДГОТОВКА КЛЕТОК Конечной целью изучения фсрментных систем бактерий является получение нсчсрпывающей информации о различных реакциях, протекаюпнгх в клетках, которая позволила бы понять, как эти реакции вплетены в ткань жизненных процессов. В идеале такие исследования должны проводиться па растущих клетках с интактной структурой и ненарушенным метаболизмом. Во многих случаях это удается осуществить, однако чаще всего приходится использовать менее идеальный источник получения клеточных компонентов. Прежде всего исследователь должен решить, какой тип препарата больше всего соответсзвует целям эксперимента. И, хотя уже проведено огромное количество экспериментов на сотнях различных штаммов бактерий, очень трудно сформулировать какие-либо определенные рекомендации относительно выбора «наилучшего» метода. Здесь применимо только правило оптимального выбора: использовать препараты дезинтегрированных клеток в тех случаях, когда их невозможно сделать проницаемыми, и делать клетки проницаемыми, если нет возможности работать с интактнымн покоящимися илн растущими клетками.
18.1.1. Интактные клетки Растри1ие клетки Все основные жизненные процессы, протекающие с активно растущих бактериях, включая размножение, имеют высокоорганизованный и строго регулируемый характер и во многих отношениях представляют собой 376 18. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ идеальную систему для исследования ферментов. Во время роста клеток все их метаболические системы находятся в подвижном равновесии: питательные вещества и ионы поступают в клетки, а конечные продукты метаболизма выводятся. Во всех случаях, когда это возможно, желательно использовать интактные растущие клетки. Покоящиеся клетки Рост клеток можно осгановить, если отделить их (путем центрнфугирования или фильтрации) от питательной среды и суспендировать в «нейтральной», осмотически подходящей среде, например забуференном физиологическом растворе нли минерально-солевой среде, лишенной источников углерода и азота (разд.
25.1). Обработанные таким образом клетки называются покоящимися. Они обладают тем же набором ферментов, что и растущие клетки, но находятся в относительно неактивном состоянии. На таких клетках можно изучать реакции или группы реакций, представляющие особый интерес.
Например, можно определять поток электронов, идущий от субстратов, таких, как П-лактат или сукцинат, через систему дыхания в условиях, когда рост и метаболические требования минимальны. Покоящиеся клетки некоторых видов способны синтезировать белки, и их часто используют для изучения этого процесса. Кроме того, покоящиеся клетки служат объектом при изучении транспортных процессов, включая транслокацию субстратов и ионов. С этой целью отмытые клетки обычно суспендируют в осмотически пригодной среде, содержащей для подавления синтеза белка хлорамфеникол (50 — !00 мкг/мл). При проведении некоторых экспериментов, например связанных с изучением транспорта, часто рекомендуется использование эндогенных источников энергии (разд.
19.2). Голодающие покоящиеся клетки Бывают случаи, когда клетки полностью лишают эндогенных источников энергии. Прекрасный пример использования голодающих покоящихся клеток — измере- 377 чАсть пл метАБОлизм ние внутриклеточного АТР, образующегося за счет хемиосмотического мембранного потенциала. В неголода|ощих клетках выявление АТР„синтезированного за счет хемиосмотического градиента (49), затруднительно нз-за высокого фонового уровня АТР. Методика голодания для Е.
со!1 была разработана Кохом !25!. При ее использовании клетки Е, со!! быстро утилизируют резервные питательные вещества в циклическом процессе фосфорилирования/дефосфорилироваиия а-метилглюкозида, который у этих бактерий фосфорнлируется при участии фосфоенолпируват-фосфотрансферазной системы. Клетки собирают центрифугированием при 4'С и промывают основной средой или 0,12 М тряс НС1, рН 8,0. Затем их суспендируют до плотности 5 мг клеток (сухого веса) на ! мл основной среды, содержащей 20 ММ а-метнлглюкозида и 40 мМ азида натрия, и инкубируют при 37'С от 45 до 120 мин в зависимости от используемого штамма. После этого клетки снова центрифугируют, промывают и ресуспендируют в соответствующем растворе (разд.
25.1) . Более обычный способ подавления эндогенного метаболизма, по крайней мере у аэробов или факультативных аэробов, заключается просто в энергичном аэрировании густой суспензии клеток (в основной среде нли буфере) в течение 2 — 4 ч илн дольше, если это необходимо. За сокращением запасов питательных веществ в клетках можно следить, измеряя максимальное снижение эндогенного дыхания Я (0~) относительно уровня Я (0~), необходимого для окисления какого-либо субстрата, например глюкозы.
18.1.2. Проницаемость клеток Работа с интактными клетками имеет свои трудности. Главная трудность заключается в том, что как растущие, так и покоящиеся клетки непроницаемы для большинства субстратов, кофакторов и метаболитов, обычно используемых при определении ферментов. Принято считать, что лучше всего изучать фсрментативные реакции в условиях, когда белок-белковые (или белокмембранпые) взаимодействия между молекулами одного фермента (гомологичные взаимодействия) или меж- 378 18. ФЕЬМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ду молекулой данного фермента и молекулой другого белка (гетерологичные взаимодействия) подобны тем, которые существуют !п 81(п [42], Хотя при использовании интактных клеток данное условие выполняется, это малоутешителыю, если необходимые субстраты не могут проникать через клеточную мембрану. ОбРаботка растворителями СУщ~ст~У~т РЯД методик, позволяющих более или менее успешно делать целые клетки более проницаемыми и тем самым использовать их для исследования ферментов.
Например, при обработке клеток Е. сой растворителями (толуолои или бензолом) они становятся проницаемыми для [1-галактозидов, которые проникают в клетки и подверга|отся гидролизу р-галактозидазой [4]. Растворители применяются также при определении фосфоенолпируват-фосфотрансферазной системы у Е. соИ [17]. Для обработки клеток используются также различные растворы толуола в этаноле.
Иногда такая обработка сопровождается замораживанием и оттаиванием клеток [6). Обработка хелатообразующими агентами Обработка энтеробактерий хелатобразующим агентом (трио-ЭДТЛ) была успешно применена для того, чтобы сделать их проницаемыми и, следовательно, чувствительными к актиномицину 0 [26]. Рекомендуется [42] шире применять такую обработку при изучении сложных систем, таких, как ферменты, связанныс с мембранами, и ферменты взаимопревращения.
Более того, везде, где это возможно, следует сравнивать ферментативные активности обработанных и интактных клеток. 18.1.3. Препараты дезинтегрированных клеток Во многих случаях целые клетки, как проницаемые, так и непроницаемые, бывают непригодны или слишком сложны для исследований, и тогда приходится прибегать к дезинтегрзрованным клеточным препаратам. 379 ЧАСТЬ !Ч. МЕТАБОЛИЗМ Впервые работа с использованием таких препаратов в качестве источника Ферментов была опубликована в !897 г. Бюхнером. Эксперименты Бюхнера называют «одними из основополагающих экспериментов в современной биохимии, стоящими в одном ряду с опытами Лавуазье в химии» 1'22).
Методы дезинтеграции бактериальных клеток уже обсуждались в настоящем руководстве в связи с выде лением клеточных структур 1разд. 5.1) Разруитение клеток под действием осмотическик сил Бактепиальные клетки разру|пают различными способамн, Пожалуй, самым мягким из всех механических способов разрушения клеток является разрушение клеточной мембраны под действием гндростатнческого (осмотнческого) давления. Для большинства бактерий этот метод неприменим, если не обрабатывать предварительно клеточные стенки Ферментами илн не изменять их структуру другими способами. Применение осмотнческого шока оказалось очень полезным ппи изучении некоторых ферментов грамотрипательных бактерий. Эти ферменты локалнзчются между плазматической мембраной и наружными слоями клеточной стенки в пернплазматнческом пространстве, и поэтому их называют «периплазматическими» ферментами )32, 331.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
