Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 73
Текст из файла (страница 73)
Обычно это гидролазы, такие, как щелочная фосфатаза, рибонуклеаза 1 и циклическая фосфодиэстераза, Меток выделения этих Ферментов из клеток Е. соБ описан Хьюзом и др. ~22). Он включает следующие этапы." 1) тщательное промывание клеток свежей средой нлн соответствующими буфсрамн; 2) счспснднрование промытого осадка клеток в растворе 0,5 М сахарозы (80 частей); 3) центрифугнрованне н декантирование падосадочной фракции; 4) быстрое днспергированне осадка путем сильного встряхивания в холодном 8.10-« М растворе МдС1, (80 частей); 8) центрнфугирование и изучение иадосадочной фракции с целью выявления пернплазматических ферментов.
Обработка смесью лнзоцим — ЭДТА также является прекрасным способом быстрого и мягкого лизиса грам- 380 !8, ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ отрицательных клеток. Ее проводят при низкой или комнатной температуре. В осмотически щадящей среде (для того, чтобы не произошло полного разрушения клеток) при этом образуются сферопласты. Таким способом можно одновременно обрабатывать до 30 л клеток. С помощью этой мягкой обработки можно выделить всю фракцию полирибосом. Для оптимального разрушения клеток бактерий различных видов используют разные концентрации растворов буфера, ЭДТА и лизоцима.
Приведенная ниже методика первоначально была описана Репаске 137] для разрушения клеток Е. со(1. Промытые клетки суспендируют в 3 мл смеси, содержащей 100 М трис НС!, рН 8,0, 0,8 мг ЭДТА, рН 7,5, 50 мкг лизоцнма и воду. Ливис начинается после добавления лизоцима; его можно проводить при комнатной температуре в течение 5 мин или же на холоду. Мягкая осмотическая обработка применяется также при выделении протопластов и мембранных везикул грамположительных бактерий. Выделенные с ее помощью препараты чрезвычайно полезны прн изучении транспорта веществ через бактериальную мембрану. Способы их получения обсуждаются и описываются в следующей главе (равд.
19.3). Дезинтеграция Опубликованы обзоры по различным физическим и химическим методам дезинтеграции бактериальных клеток 1'6, 22). В них, особенно во втором, читатель найдет более подробную информацию, касающуюся применения этих методов. Из всех имеющихся средств эффективными для разрушения клеток бактерий (и дрожжей) являются пресс Френча или подобные ему устройства, вибрационные мельницы, ультразвуковые дезинтеграторы, некоторые ручные мельницы и пресс Хьюза.
Большинство других устройств предназначено для специальных целей или же эффективно при обработке организмов, которые разрушаются легче, чем бактерии (например, ткани простейших нли ткани животных). Наиболее полезный и эффективный химический способ дезинтеграции клеток включает использование литических агентов (таких, как лизоцим или лизоцим в сочетании 381 члсть не метлволизм с хелатобразующими агентами, например ЭЛТА). Ниже кратко описаны наиболее подходящие приборы, используемые в настоящее время для разрушения клеток в бактериальной энзимологии.
Пресс Френча. Пресс Френча — очень эффективное устройство для разрушения клеток многих видов микроорганизмов. В продаже имеется много вариантов этого устройства. Простейшее из них состоит из камеры, помещенной в лабораторный гидравлический пресс, способный создавать общее давление 10 — 20 т. В камеру вносят клеточную суспензию, которую подвергают действию поршня. Клетки эффективно разрушаются при выходе суспензии под давлением из маленького отверстия камеры.
Одной рукой можно регулировать давление гидравлического пресса, а другой скорость выталкивания клеток через игольчатый клапан. В продаже имеется устройство с автоматическим гидравлическим прессом (Ашег)сап 1пз(гцгпеп1 Со., 811чег Зрг1пц, Мг(.), а также усовершенствованный вариант этого устройства (Зогиа!1 — %Ы ГгасВопа1ог, 1чап Ботча!! 1пс., Могла(к, Сопп.). Предварительно охлажденный пресс Френча заполняют суспензией клеток. Поршень заранее устанавливают таким образом, чтобы объем камеры был равен 5, 1О, 20 илн 50 мл. Систему устанавливают (с поршнем в нижнем положении) на специальный штатив, добавляют немного избыточного количества суспензии клеток и открывают игольчатый клапан, чтобы при закрывании крышки камеры избыточная жидкость выливалась через отверстие.
(Это обеспечивает вытеснение воздуха из камеры и предотвращает выход сжатого воздуха вместе с последней порцией суспензии.) Закрывают игольчатый клапан и собранный аппарат помегдают (с поршнем в нижнем положении) на гидравлический пресс.
Подают давление 6,8 10" — 20,4 10' Па и поддерживают его на постоянном уровне во время медленного просачивания суспензии через соединенную с отверстием трубку в соответствующий охлажденный приемник. Этим методом можно разрушать большинство бактерий, даже те, которые разрушаются особенно трудно, например микобактерин. Суспензию грамотрицательных 18. ФвгментативнАя Активность кокков часто требуется пропускать через пресс повторно. Помимо того что этот способ разрушения очень удобен и эффективен, он имеет еше одно достоинство: при его использовании инактнвацня ферментов минимальна. Рекомендуется использовать относительно густые суспензии клеток: около 0,5 г клеток (сырого веса) пли больше в 1 мл (22).
В густых суспензиях разрушение клеток происходит лучше, а инактивация ферментов меньше, чем в разбавленных. Вибрацианныв мельницы. Наиболее часто используются вибрационные мельницы марки М(сЫе (М1сЫе 110., М111 %огня, УошзЬаП, Япггеу, Епд!апд) и Ыозза! (МсОопа!д Епп!пеег(пп Со., Вау %1!аде, ОЫо). Недорогую вибрационную мельницу для небольших объемов клеток можно изготовить с помощью зубного амальгаматора (например, модель ЕР-60, Сгезсеп1 Со., Еуопз 1!1.).
К суспензии клеток добавляют мелкие стеклянные шарики (5прегЬгйе п!азз Ьеадз, угаде ! 10, М!ппезо!а М!п!пп апд Манн!ас!нг!пп Са., Мшпеаройз Мшп. или Ва!!оВп! Венда, Епп1!зЬ О!азз Со., 1Ы., 1.е1- сез(ег, Епц!апд) н смесь помешают в стеклянную или металлическую капсулу, поставляемую фирмой-изготовителем. Для оптимального разрушения эмпирически подбирают соотношение объемов шариков и клеток, которое обычно равно 1: 1.
Объемы смеси, как правило, не превышают 25 мл. Для обработки с помощью мельницы М!сЫе требуется длительное встряхивание. Меньшее время затрачивается при работе с мельницей Ь)озза! с повышенной вибрацией. Во время встряхивания образуется тепло, поэтому применяют какую-либо охлаждающую систему. Для охлаждения мельницы !чозза!, например, используют систему с СОм Обработка ультразвуком. Разрушение клеток ультразвуком обусловлено кавитационными силами, создающими ударные волны или кавитационный микропоток, что способствует химической атаке свободными радикалами. Каким бы ни был механизм дезинтеграции, ультразвуковая обработка — очень эффективное средство разрушения бактериальных клеток. В продаже имеются различные ультразвуковые дезинтеграторы.
Хотя можно обрабатывать и относительно густые суспензии клеток, эффективность разрушения в вязких 383 чАсть гт метАБОлизм растворах значительно снижается. По мере выхода крупных молекул„например ДНК, суспензия становится более вязкой и разрушение клеток ухудшается. Более разбавленные клеточные суспензии быстрее разрушаются ультразвуком. Время обработки обычно определяют эмпирически, учитывая необходимость отвода выделяющегося тепла, а также чувствительность ферментов к ииактивации.
Клеточную суспензию охлаждают, помещая сосуд, в котором она находится, в лед или смесь льда с солью, или же холодной водой, циркулирующей между двойными стенками сосуда. Кончик датчика прибора опускают на несколько миллиметров ниже поверхности жидкости. Затем устанавливают генератор на рекомендуемую мощность и настраивают прибор на нужную частоту (резкий шипящий звук соответствует наиболее эффективному разрушению клеток). После необходимого периода обработки изменяют подаваемую частоту и выключают прибор.
Для заглушения шума, издаваемого прибором, рекомендуется создать акустическую защиту вокруг датчика. По-видимому, ультразвуковая обработка — наиболее быстрый и легкий способ разрушения клеток. Еше одно его достоинство заключается в том, что с его помощью эффективно разрушаются самые различные бактерии.
Все это позволяет широко применять этот способ в бактериологических исследованиях. Растирание клеток с окисью алюминия. Это один нз наиболее дешевых способов разрушения бактерий. Для него необходимы лишь ступка, пестик и порошок окиси алюминия (например Ро!(зй1пд А!пш1па, угаде А-301, Г1зсйег ЯС1еп(11!с Со.). Окись алюминия промывают и высушивают при 100'С. Замороженный (или охлажденный) осадок клеток помешают в охлажденную ступку. Соотношение охлажденной окиси алюминия и клеточной массы — 1: 2 (по весу).
Энергично растирают смесь 2 — 5 мин. За это время порошкообразная смесь преврагцается в липкую, клееобразную массу„что свидетельствует о разрушении клеток. Добавляют соответствующий буфер, ресуспендируют содержимое ступки и центрифугнруют его для удаления окиси алюминия и неразрушенных клеток. Этим способом можно быстро разру- 384 !к Фегмг!!тАтивнАя Активность шить относительно большое количество клеток. Большинство бактерий, однако, эффективнее разрушается другими методами. Лресс Хьюза. Намного более аффективный способ разрушения бактерий описан Хьюзом и др. [22~.
Он основан на сдвиговых усилиях, возникающих под действием кристаллов льда внутри клеток илн абразивного порошка на поверхности клеток. Пресс Хьюза состоит из устройства для пропускания замороженной клеточной суспензин или пасты из клеток (с добавлением абразивного материала, например равного объема пирексового стеклянного порошка, илн без него) через небольшое отверстие в приемную камеру. Суспензню пропускают под высоким давлением (6,8 10' — 54,4 1О' Па), создаваемым гидравлическим прессом.
Существует несколько модификаций исходного пресса Хьюза. Пресс охлаждают в морозильнике или с помощью сухого льда от — 25 до — 30'С. В камеру помещают суспеизию или замороженный осадок клеток. Устанавливают поршень над суспензней и подают давление до тех пор, пока она не пройдет через маленькое отверстие в приемник. Разрушение клеток в замороженном виде с помощью пресса Хьюза — одни из наиболее эффекгивных способов разрушения клеточного материала разного происхождения: ог бактериофагов до животных тканей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
