Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 77
Текст из файла (страница 77)
Ниже описывается модифицированная методика Парди и др. [34). Готовят реакционную смесь, содержащую 4,1 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, и 0,2 мл 0,032 М восстановленного глутатиона. Смесь выдерживают до установлення температуры 30'С. Добавляют фермент в объеме 0,2 мл и начинают реакцию внесением 0,50 мл 0,0! М ОНФГ (предварительно инкубированного). По окончании инкубацни (обычно в течение 15 мин, но вообще это время зависит от количества фермента в клетках) реакцию останавливают. Окраска смеси усиливается, если добавить 1 мл 1 М НазСОз.
Смесь встряхивают и измеряют оптическую плотность при 420 нм За единицу ферментативной активности принимают количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоля о-нитрофенола в 1 ч в условиях эксперимента. Строят калибровочную кривую, отражающую зависимость между оптической плотностью при 420 нм и концентрацией о-нитрофенола в условиях проведения эксперимента. Клетки, обработанные толуолом, готовят следующим образом.
Пробы культуры по 1,0, 0,5 или 0,20 мл добавляют к 4,0, 4,5 или 4,8 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера, рН 7,5, для получения разведений 1: 5, 1: 10 или 1: 25 соответственно. Измерив оптическую плотность этих разведений, по калибровочной кривой можно оп- 400 18. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ределить массу (сухой вес) клеток, содержащихся в каждой пробе. Разведения культур можно хранить до анализа на 5-галактозидазу в течение 6 ч во льду. Перед самым экспериментом их вынимают из ледяной баии и обрабатывают одной каплей толуола и одной каплей 0,1%-ного дезоксихолата натрия.
Закрывают пробирки пробками, встряхивают 15 мин при 37'С и вновь ставят в ледяную баню. Для определения 5-галактозндазной активности (см. выше) из каждой пробы отбирают по 0,2 мл. 18.2.9. Лиазы (треониндегидратаза) Треониндегидратаза (КФ 4.2.1.16, 1.-треонин-гидролиаза (дезаминирующая)1 катализирует следующую реакцию: 1.-Треоиии — ~ а-Кетобутират + ИН4~. У многих бактерий имеются даа таких фермента, один нз них каталнзирует деградацию треонина, а другой— синтез. Деградирующий фермент отличается от синтезирующего индуцибельностью, т.
е. он способен синтезироваться в отсутствие глюкозы и кислорода в среде, содержащей 1-треоннн и некоторые другие аминокислоты с разветвленными цепями, однако лучше всего он синтезируется в среде, содержащей более сложную аминокислотную смесь.
Деградирующий фермент активируется в присутствии АМР. Синтезирующий фермент репрессируется конечным продуктом; его активность подавляется также 1.-изолейцином. Активность обоих ферментов измеряют по образованию производного а-кетобутирата — 2,4-динитрофенилгидразона. Деградирующий фермент исследуют в клеточных экстрактах или в клетках, Обработанных толуолом, по следующей методике 1201. В состав реакционой смеси (конечный объем 1 мл) входят 0,20 мл 0,5 М калий-фосфатного буфера (рН7,4), 0,10 мл 0,1 М АМР (нейтрализованного) и 0,20 мл 0,5М (.-треонина. Реакцию начинают при 37'С добавлением препарата фермента и останавливают внесением 1 мл 1 н. НС!. Затем добавляют 0,2 мл 0,18!о-ного 2,4-динитрофенилгидразина и смесь нновь инкубируют при 37'С.
Приблизительно через 10 мин добавляют 2 мл 2 н. ЧАСТЬ ИА МЕТАБОЛИЗМ МаОН и в колориметре измеряют оптическую плотность гидразона прн 416 нм. Строят калибровочную кривую, отражавшую зависимость между оптической плотностью и концентрацией натриевой соли а-кетобутирата в условиях эксперимента. За единицу фермента принимают такое его количество, которое катализирует образование 1 мкмоля и-кетобутирата в 1 мин в указанных условиях. Синтезирующий фермент определяют по методике с использованием лизированных клеток илн клеточного экстракта 118]. Ниже приведено описание методики с экстрактами. Реакционная смесь (конечный объем 1,0 мл) состоит нз 0,10 мл 1 М трио НС1, рН 8,0, 0,10 мл 1 М ИН4С!, 0,1 мл 1 ММ пиридоксальфосфата, 0,20 мл 0,2 М Ь-треоиина и 0,10 мл экстракта.
Объем смеси до 1,0 мл доводят водой. Для каждой серии анализов готовят контрольную пробу без Ь-треоиина. Пробирки инкубируют прн 37 'С в течение заранее определенного времени (около 10 — 20 мин). Останавливают реакцнкз добавлением 0,10 мл 50%-ной ТХУ и определяют образование а-кетобутирата, как описано выше. 18.2ЛО. Изомеразы (1.-арабинозоизомераза) 1.-Арабинозоизомераза (КФ 5.3.1.4, 1.-арабиноза кетол-изомераза) катализирует следующую изомеразнуиз реакцию: 1.-Арабииоза — 4 Ь-Рибулоза Этот фермент можно определять в непрерывной системе (481, описанной выше для анализа киназы, в сочетании со следующими сопряженными реакциями: Ь-рибуаовокниава 1.-Рибулоза + АТР -~ 1.-Рибулозо.б-Ф + А14Р; Пируваткиназа Е Е г, енот Н и„ватт: Лактатаегиарогеназа Пируиат + 1йдгзН -з" Лактат+ 1йАП.
1.Арабинозоизомеразу можно также исследовать с помощью простого спектрофотометрического метода, основанного на определении образовавшейся кетопентозы с помощью реакции Дише и Боренфройнда на цистенн- 402 1Е. ФЕРМВНТАТНВНАЯ АКТИВНОСТЬ карбазол с использованием 1-арабинозы в качестве субстрата [411. Эту реакцию можно проводить с неочищенными клеточными экстрактами или с клетками, обработанными толуолом, так же как в случае с 8-галактозидазой. Реакционная смесь (1,0 мл) состоит из 10 мкмолей 1-арабинозы, 43 мкмолей трис-буфера, рН 7,5, и препарата фермента в нужном разведении (экстракт или клетки, обработанные толуолом).
Для каждой серии анализов готовят контрольные смеси без фермента, После 10 мин инкубации при комнатной температуре (или 30'С) добавляют 0,20 мл 1,5%-ного раствора цистеннгидрохлорида и 6 мл смеси, приготовленной из 190 мл Воды и 450 мл конц. Н1501. Сразу же после этого добавляют 0,2 мл 0,12о1е-ного спиртового раствора карбазола. Смесь встряхивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Измеряют оптическую плотность при 540 нм в колориметре или спектрофотометре.
За единицу активности принимают количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоля (.-рибулозы в 1 мин в указанных условиях. Для построения калибровочной кривой (в пределах 0 — 0,25 мкмоля), отражающей зависимость между оптической плотностью при 540 им и концентрацией (.-рибулозы в данных условиях, используют имеющийся в продаже 1.-рибулозо-о-нитрофенилгидразон. 18.2.11. Лигазы (глутаминсинтетаза) Глутаминсннтетаза (КФ 6.3.1.2, (.-глутамат: аммиак лигаза (образующая А11Р)) участвует в первом этапе сильно разветвленного пути„ведущего к биосинтезу многих важных конечных продуктов. У Е.
со11 и К1ебз(еПа аегойепез этот строго регулируемый фермент подвержен: 1) репрессии/дерепрессии, 2) сложному ингибировапию по типу обратной связи и другим аллостерическим изменениям, а также 3) ковалентной модификации. Глутаминсинтетаза катализирует следующую реакцию: Меем Глутлмат+ 1ЧНе+ АТР— е Глутамат+ АОР+ Неоргаиическиа фосфет. Ее активность можно определять несколькими различ- ЧАСТЬ !У. МЕТАБОЛЙЗМ ными способами [40), в том числе с помощью описанной .выше для киназ сопряженной реакции, заключающейся в окислении ИАьгНФ: Глутамат + ГтАГгН++ ХНа+ + фосфоенолиируиат Пируиаткиназа Лактатдегидрогеназа Глутанинсинтетаза Глутамин+ НАР+ Лактат + Неорганический фосфат. Хотя в реакционную смесь добавляют АТР н в результате глутаминсинтетазной реакции образуется АРР, в суммарном уравнении эти два вещества не фигурируют.
При такой постановке эксперимента непрерывная ретистрация каталитической активности достигается благодаря сопряжению образования АРР, катализируемого глутамннсиитетазой, и окисления 'гт)АЙНФ, каталнзируемого пируваткиназой и лактатдегидрогеназой в присутствии фосфоенолпирувата (последние три компонента добавляют в избытке). Этот удобный, чувствительный и прямой метод, позволяющий осуществлять различные кинетические измерения, не пригоден, однако, для ана.лиза ингнбирования по типу обратной связи, так как на активность ферментов могут также влиять различные эффекторы. При изучении регуляции (путем аденилирования/деаденилирования) глутаминсинтетазной активности с помощью ковалентной модификации очень удобен транса)зеразный тест, включающий реакцию АДФ. Арсенат Глутамин+Гндроксиламин е — -у-Глутамилгидроксамат+МНа+.
По этой реакции определяют общее количество присутствующей глутаминсинтетазы, так как и аденилированная и деаденилированная ее формы активны. Кроме того, можно использовать целые клетки, сделав нх проницаемыми для реагентов путем обработки бромидом гексадецилтриметиламмония. Определение активности глутамннсинтетазы у Е. сой подробно описано Штадтманом и др. [451, а у Иеозгейа пегой'епез — Бендером и др. [31.
Ниже приведена методика из второго источника [31, представляющая собой вариант методики Шапиро й Штадтмана [401. Реакционную смесь готовят ежедневно из указанных 404 1В. ФНРМВНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ объемов основных растворов (в скобках даны конечные концентрации каждого компонента: 7,53 мл воды; 2,25 мл 1 М нмидазола НС1, рН 7,15 (135 мМ); 0,37 мл 0,80 М гндроксиламингидрохлорида (18 мМ); 0,045 мл 0,1 М МпС!т (0,27 мМ); 1,5 мл 0,28 М арсената калия, рН 7,15 (25 мМ); 0,15 мл 40 мМ 5(а-АРР, рН 7 (0,36 мМ); 1,5 мл бромида гексадецилтрнметиламмония с концентрацией 1 мг/мл (90 мкг/мл), Если в опыте используют неочищенный экстракт клеток или очищенный фермент, последний раствор заменяют водой. Доводят рН этой концентрированной смеси до 7,55 с помощью 2 М КОН Нри комнатной температуре и охлаждаютдо 4'С,если опытначинают несразу. К 040мл этой смеси добавляют фермент и доводят объем до 0,45 мл водой.
Выдерживают 5 мин при 37'С для выравнивания температуры н начинают реакцию добавлением 0,05 мл 0,2 М Е-глутамина. После инкубации в течение необходимого времени реакцию останавливают добавлением 1 мл «стоп-смеси». В состав этой смеси входит РеС1в 6НьО (55г), ТХУ (20г), конц. НС1 (21мл) и вода (до 1 л). Пробы центрифугируют для удаления осадка и измеряют оптическую плотность при 540 нм.