Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 81
Текст из файла (страница 81)
с культурой 2 обнаруживается снятие этой репрессии экзогенным сАМР. Культуры 5 и б демонстрируют репрессию и дерепрессию синтеза р-галактозидазы в различные отрезки времени и в более выраженном виде. Результаты подобного эксперимента представлены на рис. 18.7. Возможны варианты описанной выше постановки эксперимента, например, можно применять другие субстраты, менять аэробные условия на анаэробные и наооборот, использовать различные мутантные штаммы (например, мутанты суа и сгр и т.д.). Ставя подобные эксперименты, можно изучать регуляцию других ферментиых систем, например системы, кодируемой опероном 1 -арабннозы (ага), нли деградирующую треониндегидратазу, образующуюся только в анаэробных условиях.
18.5. АНАЛИЗ ПУТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА Ферменты существуют не в виде отдельных самостоятельных компонентов, функционирующих независимо и случайно, а в виде ансамблей, отдельные элементы которых взаимосвязаны и выполняют свои функции взаимозависимо в определенной последовательности. Бакте- 421 чдстыж мвтдволизм $ в ~в 18.5.1. Общие методы Иденти4икацлл промелсуточногх продуктов В процессе катаболизма некоторых субстратов растущими или покоящимися бактериальными клетками в среде могут накапливаться промежуточные продукты, где их легко идентифицировать различными химически- риальную клетку можно в действительности рассматривать как одну большую многоферментную систему, работе которой присуща определенная гармония. Помня о целостности системы, в практической работе мы, однако, вынуждены иметь денли иные пути метаболизма. Путями метаболизма обьгчно называют последовательность координированных реакций, имеющих биосинтетическое или биоэнерРнс.
16.6. Временное появление гетическое значение, напри- промежуточного продукта метаболизма субстрата в процессе мер цепь пеРеносчиков элекроста бактериальной культуры, тронов, гликолитический путь илн пути биосинтеза аминокислот с разветвленными цепями. Именно изучение таких путей, а не исследование отдельных ферментов способствовало накоплению современных знаний о метаболизме бактерий.
Подробный анализ и оценка имеющихся в настоящее время методик изучения путей метаболизма даны в работе Дэгли и Чэпмена [81, В последующих разделах данной главы кратко обсуждаются общие методы, описанные этими авторами, и достаточно подробно описано оборудование для радиоизотопных работ. Это поможет получить общее представление о методах изучения путей метаболизма. !К ФЕРМЕНТАТИЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ми, хроматографнческими или радиоизотопными методами. Один или несколько промежуточных продуктов будут накапливаться в том случае, если скорость их синтеза превышает скорость диссимиляции в ходе последующих реакций определенного пути метаболизма. Когда происходит исчерпание исходного субстрата, как показано на рис. !8.8, накопление часто сопровождается потреблением.
Например, культуры Е. со)!, растущие на богатой среде с глюкозой в качестве основного источника углерода и энергии, накапливают п затем утилизируют пируват. С помощью такого типа исследований получена существенная информация о путях метаболизма, связанных с разложением ароматических веществ. Использование ингибиторов метаболизма В исследованиях путей метаболизма широко используются ингибиторы.
При добавлении в культуру ингибитора какого-либо этапа пути метаболизма может происходить накопление одного или нескольких метаболитов, образовавшихся до этого этапа, которые благодаря такому накоплению легко идентифицировать. Получаемую при этом информацию можно использовать для установления последовательности реакций. Например, наши знания о химической природе стенок микробных клеток основаны на том наблюдении, что при обработке клеток 8гарпу1осоееиз аигеиз, 31тер1оеоссиз гаеса1!з или Е. соИ такими антибиотиками, как пенициллин, бацитрацин илн циклосерии, накапливаются различные нуклеотиды, участвую!цие в биосинтезе клеточных стенок. Если ингибиторы (метаболические яды) оказываются эффективными в подобных исследованиях, очевидно, клетки должны быть проницаемыми для них. При оценке данных, получаемых с использованием ннгибиторов, всегда следует проявлять осторожность, поскольку могут существовать неизвестные этапы ингнбирования.
Использование аналогов субстрата !Рерменты определенного пути метаболизма могут различаться по субстратной специфичности. Например, может оказаться, что первые три фермента способны 423 часть пк мвткволизм взаимодействовать с аналогом природного субстрата, а четвертый — нет. В этом случае будет накапливаться частично метаболнзированный аналог, который несложно идентифицировать, благодаря чему легче определить место соответствующих реакций в цени метаболизма.
Одновременная адаптация Метод одновременной адаптации основан на следующем логическом построении. Если индуцибельный днссимиляционный путь (например, А — э- — э-С вЂ” +Т1- цикл трикарбоновых кислот) индуцируется необходимым для роста субстратом А, у клеток развивается способность к диссимиляцин метаболитов В, С, О, так же как и А, но не других веществ, не являющихся промежуточными продуктами этого пути метаболизма. Если, например, путь включает окисление всех указанных компонентов, можно ожидать окисления (измеряемого с помощью аппарата Варбурга (равд.
16.6) или кислородного электрода (равд. 16.2.3)1 субстратов А, В, С и Р, но не Е, Р и С, если только клетки не способны конститутнвно утилизировать одно или несколько из последних веществ. Такую способность можно определить с помощью теста на их окисление, используя клетки, выращенные не на субстрате А. Не исключено, одкако, что субстраты В, С или 1э, являясь компонентами пути, не могут проникать в клетки и вследствие этого не будут подвергаться окислению. Для определения этой возможности необходимо использовать клеточные экстракты или пермеабилизоваиные клетки, обработанные с целью повышения проницаемости.
Использование клеточных экстрактов Большинство описанных выше методик можно осуществить, используя вместо целых клеток клеточные экстракты. Накопление промежуточных продуктов и (или) кофакторов может происходить спонтанно, или его можно инициировать, используя метаболические яды или аналоги субстратов. При использовании клеточных экстрактов трудности, связанные с проникновением веществ в клетки, устраняются, что упрощает анализ. Од- 18.
ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ пако ферменты изучаемого пути метаболизма не находятся при этом в своей естественной среде, и поэтому их активность может изменяться или они вообще могут быстро инактнвироваться. Использование радиоизотопов Использование радиоизотопов, в частности соединений, содержащих "С, 88Р, 8Н или 885, чрезвычайно важное средство изучения путей метаболизма. Описание и оценка различных методик, разработанных для этой цели, содержатся в работах Дэгли и Чэпмена ~81, Квейла ~35), Уоига [47~ и Итона ~141, поэтому здесь мы рассмотрим их лишь в обших чертах. Во-первых, следует отметить, что этп методики имеют свои трудности н «подводные камни».
Главнейшая пз трудностей связана с необходимостью работы с чистыми веществами. «Перед использованием радиоактивной метки необходима тщательная проверка ее чистоты, так как лучше вообще не работать, чем работать с нечистым исходным веществом» 48~. Плакат с этим предостережением висит сейчас в моей лаборатории. Пытаясь проследить путь второй транспортной системы для глюкоза-б-фосфата, мы потеряли массу времени только на то, чтобы установить, что это артефакт, возникающий из-за присутствия небольшого количества примеси свободной '"С-глюкозы во всех препаратах "С-глюкозоб-фосфата, за исключением свежеприготовлениых. Эти соединения мы использовали в опытах в качестве субстрата.
Даже при использовании чистых веществ проследить судьбу меченых молекул одного вида среди несметного числа взаимосвязанных и часто обратимых потоков метаболических реакций непросто. Чем быстрее метаболизы входят в активные метаболические пулы, тем труднее выявить их специфические функции. Поскольку активно делящиеся бактерии (в отличие от покоящихся клеток) прежде всего осуществляют реакции синтеза, оборот и перераспределение метаболитов у них сводится к минимуму. Поэтому для радиоизотопного анализа путей метаболизма рекомендуется использовать по возможности активно делящиеся бактерии.
Полезно также 42ь чАсть !у метАБОлизм использование соответствующих мутантных штаммов с дефектом, который снижает до минимума или исключает распределение н 1или) оборот мстаболитов. На примере биосннтеза аминосахаров можно показать преимущества, получаемые при использовании радиоактивной метки в экспериментах с соответствующими мутантнымн штаммами. )М-Ацетнлглюкозамин транспортируется в клетки с помощью фосфоенолпируват-фосфотрансферазной системы и затем подвергается 1) днсснмнляции посредством вступления в гликолитический путь через дезаминированне глюкозамин-6-фосфата с образованием МН4- и фруктозо-6-фосфата и 2) ассимиляции с образованием макромолекул аминосахаров согласно пути, показанному на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
