Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 78
Текст из файла (страница 78)
В этих условиях 1 мкмоль глутамнлгидроксамата при 540 нм имеет оптическую плотность 0,532. За единицу активности принимают количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоля глутамилгидроксамата в 1 мин, а удельную активность находят, поделив активность фермента на количество клеточного белка в миллнграммах. Для каждой серии опытов готовят контрольные пробы, содержащие вместо растворов арсената н АПР воду.
Это позволяет сделать поправку на у-глутамилгидроксамат, образующийся благодаря возможному присутствию любой глутамнназы. При таком определении и аденилированная и неаденилированная формы фермента активны. Для определения активности только неаденилированного фермента к реакционной смеси добавляют 60 мМ МдС!с при рН 7,15. Штадтман и сотр. 140, 451 вычислили значение л (состояние аденилировання) для этого фермента у Е. СоД в условиях, сходных с описанными выше: Активность в 0,4 М МпС1ь+ 60 мМ МИС1м РН 7,2 и =!2 — 12 Активность в 0,4 М МпС1м рН 7,3о 405 члсть ип мвтхволнзм 18.3.
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ 18.3.1. Общие замечания После точного, чувствительного и стандартизированного определения активности фермента можно переходить к выяснению вопроса о том, подвергается ли фермент одному или нескольким процессам регуляции метаболизма. Показано, что у бактерий существуют два основных типа регуляции ферментативной активности— аллостерический и ковалентная модификация. Виды аллостерической регуляции ферментативной активности: Простое ингибнрование конечным продуктом Кумулятивное ингибирование конечным продуктом Последовательное ингибирование конечным продуктом Стимуляция предшественником Ингибироваиие предшественником Стимуляция продуктом Ингибирование продуктом Регуляция с помощью энергетического заряда Катаболитное ингибированне Виды регуляции с помощью ковалентной модификации ферментов: Фосфорилирование АОР-Рибозилироваиие Аденилирование Уридилирование Конверсия сульфгидрила Названия видам аллостерической регуляции даны в соответствии с тем, какое положение занимает эффектор в метаболическом пути (дальнейшее обсуждение этого вопроса см.
в работах 12, 16, 21, 40, 44 и 461. Прн современном уровне биохимических знаний!и ч1чо трудно анализировать процессы регуляции, а иногда и невозможно. Иногда возникает вопрос, действительно ли эти процессы имеют место в бактериальных клетках илн они существуют лишь в воображении исследователя, но мы не будем здесь его обсуждать. К перечисленным выше видам регуляции следует относиться критически. При изучении аллостерической регуляции обычно прово- 406 1Э. ФЕРМЕИТАТИВИАЯ АКТИВНОСТЬ Рнс, 18.2.
Влияние положительных и отрицательных ~ эффекторов на аллостеричсскую регуляцнео ферментатнвной активности, ь Е О о Каиценярацая гудстраюа ь ннннтнвннтюнтнй, щи ныиаитинию юРЕИ иениент нитивинтятитин итннент ФЕРМЕН! ЕК неннтнвинтн ивнинитеинввнтинй фермент дят эксперименты !и уйго. К реакционной смеси добавляют соединения, которые предположительно участвуют в регуляции — так называемые эффекторы,— и изучают их влияние на общий ход реакции.
При аллостерических взаимодействиях влияние этих эффекторов наблюдается сразу же; оно обратимо н зависит от их концентрации. Для аллостерических ферментов график зависимости начальной скорости реакции от концентрации суб- 407 Рис. 18.3. Регуляция ферментативной активности с помощью ковалентной модификации. В простейшем виде этот процесс включает участие ннактивирующего, или модифицирующего, фермента, который каталиэирует ковалентиое (Е+Х~ЕХ) нэменение основного фермента, а также активнрующего,, фермента, котормй каталиэирует обратный процесс (ЕХ-ьЕ+Х), восстанавливая тем самым исходную ферментатианую активность.
Е~БЕТРАТ РРОАУкт Йитивний нечвниенцинвввттный юеРиент ЧАСТЬ Ш МЕТАБОЛИЗМ страта имеет сигмоидную форму, тогда как для обычных ферментов он имеет вид гиперболы. Вероятно, это происходит потому, что субстрат, помимо собственной функции, выполняет функцию эффектора. Однако сигмоидиая форма может быть обусловлена не только этим. Влияние положительных (ускоряющих) и отрицательных (ингибирующих) эффекторов на аллостерическую регуляцию иллюстрирует рис. 18.2 Подробно этот вопрос рассматривается в работах 12, 16]. По сравнению с контролем, когда эффекторы отсутствуют, для достижения необходимой скорости реакции в присутствии отрицательного аллостерического эффектора необходимы ббльшие концентрации субстрата, а в присутствии положительных эффекторов — меньшие.
Предполагают, что это обусловлено связыванием различных эффекторов со специфическими сайтами узнавания на ферменте. Такое взаимодействие приводит к конформационным изменениям в молекуле фермента, что отражается на его способности связывать субстрат и на скорости реакции. В процессе регуляции ферментативной активности путем ковалентной модификации [21] происходит ковалентное связывание лиганда с ферментом, а не простое обратимое, как при аллостерической регуляции. Это ковелентное связывание катализируется другим ферментом, как показано на рис.
18.3. Активный (взаимно превращаемый) фермент превращается в неактивный с помощью другого фермента (инактивирующего), который ковалентно модифицирует первый. Другой фермент (активирующий) катализирует переход фермента в исходное активное состояние путем удаления появившихся ковалентных связей. Эксперименты, иллюстрирующие оба типа регуляторных процессов (путем аллостерического и ковалентного связывания эффекторов), описаны ниже. 18.3.2.
Аллостерическая регуляция (простое ипгибирование конечным продуктом) Для определения треониндегидратазы (синтезирующего фермента Е. Со(() можно использовать клеточные экстракты или лизированные клетки, как было описано 408 !8. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ Таблица 18.1. Прнготовленне проб для демонстрации ннгнбнровання треоннндегндратази 1-нзолейцнном Количество, мл Компонент пробирке ! пробирка 3 пробирки 3 пробирке 4 0,1 О,! 0,1 0,0 0,0 О,! 0.6 Трнс НС!, рН 8, 1 М !ЧНтС1, 1 М Пнрндоксальфосфат 1 М 1.-Треоннн, 0,2 М Изолейцин Экстракт Вода О,! О,! 0,1 0,2 0,0 0,1 0,4 0,1 0,1 0,1 0,2 0,1л 0,1 0,3 0,1 О,! 0,1 0,2 0,!п 0,1 0,3 а Канцеитрвцин нволеациив в пробирке 2 равна ер мМ, в в пробирке 3— ! мМ.
ранее. Способность 1-изолейцнна аллостерически ингибнровать этот фермент можно продемонстрировать в следующем эксперименте (Умбэргер, личное сообщение). Пробирки с компонентами, перечисленными в табл. 18.1, инкубируют прн 37'С до 20 мин (в зависимости от активности экстракта). Затем реакцию останавливают добавлением 0,1 мл 508!о-ной (вес/обьем) ТХУ. Ртбирают часть реакционной смеси (опять же в зависимости от активности фермента) н разбавляют ее водой до 1,0 мл. Добавляют 3,0 мл 0,0258!о-ного раствора 2,4-диннтрофенилгидразина в 0,5 М НС! и оставляют смесь при комнатной температуре на 15 мин. Добавляют 1 мл 40%-ной КОН, встряхивают и измеряют оптическую плотность в колориметре Клетта — Саммерсона (фильтр 54) или в любом другом спектрофотометре или колориметре при 540 нм.
Количество микромолей а-кетобутирата, образовавшегося в реакционной смеси, определяют по ранее полученной калибровочной кривой. При такой постановке пробы могут содержать разное количество субстрата и эффектора. Результаты откладывают в виде кривой, как показано на рис. 18.2. чксть нл ыеткзолизм 18.З.З. Аллостерическая регуляция с помощью энергетического заряда Аткинсон 12) предположил, что различные ключевые ферменты, участвующие в бноэнергетпческих и биосинтезирующих процессах, аллостернчески регулируются в ответ на энергетический заряд клетки. Энергетический заряд равен сумме молярной фракции АТР и половины молярной фракции АВР (поскольку 2 моля АРР можно преобразовать в 1 моль АТР через аденилаткипазу), деленной на общее количество молей аденилатов: Энергетический наряд = (АТР + 1/еА))Р)/(ЛТР + АОР+ Ай)Р).
Эта гипотеза основывается на том, что аденилаты составляют общий пул взаимосвязанных конечных продуктов и поэтому могут регулировать различные ключевые реакции, регенерирующие энергию (Р-реакции) н утилнзирующие ее (У-реакции), как показано на рнс. 18.4. АТР— это конечный продукт Р-реакций, а А()Р и АМР— конечные продукты У-реакций. Первый тнп реакций характеризуется высоким энергетическим зарядом, а второй — низким. Считается, что регуляция таких ферментов, как фосфофруктокиназа, пнруваткиназа и цитратсинтетаза происходит с участием энергетического заряда. Для измерения ответа фермента на изменения энергетического заряда готовят реакционную смесь с постоянным суммарным содержанием аденилатов (ЛТР+ +АЭР+АМР) при нужных значениях энергетического заряда. Величина этого пула у различных видов клеток обычно варьирует от 2 до 5 мМ.
Для получения трехкомпоиентной смеси с заданной величиной энергетического заряда к смеси АМР— АТР добавляют молярную фракцию АТР, соответствующую необходимой величине энергетического заряда, а также аденнлаткнназу и инкубнруют достаточно долго для установления равновесия. Используют различные концентрации Мд'ч н субстрата(ов). Присутствие субстрата в различных концентрациях необходимо потому, что наиболее распространенным ответом фермснтов на изменение энергетического заряда является, по-видимому, изменение сродства к одному илн нескольким субстратам.
410 !8. ФЕРМЕНТЛТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ Начальную скорость ре- сиасингигиатаииг РГРииии а акции при каждой концепт- ааГРГаатииги аигРГии рации субстрата можно отложить на графике в виде функции энергетического заряда. Совокупность таких Атр АРР кривых для каждой концентрации субстрата отражает влияние энергетического заряда на изучаемый фермент.
Таким способом по описанной выше методике рекомендуется определять фос- рис. 18.4. Аллостеркческэя рефофруктокнназу. Для срав- гуляния фермеитативиоа активнения можно использовать ности с помощью эиергетического зарядя. другой фермент, заведомо нечувствительный к регуляции с помощью энергетичекого заряда.
Эти эксперименты не относятся к разряду простых и быстрых экспериментов, которые можно проводить для удовлетворения любопытства. Они могут служить информативным и полезным средством приобретения опыта изучения ферментов и уточнения некоторых контрольных параметров. аиааиГРГТГиигаииг Рглиаии, РГГГИГРИРИЮЩИИ ЗИГРГИЮ 18.3.4. Регуляция с помощью ковалентной модификации 1аденилнрование) 81! Глутаминсннтетаза занимает центральное место в метаболизме азота у Е. Сой и других бактерий.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
