Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 82
Текст из файла (страница 82)
18.9. Существуют мутантные штаммы Е, со)1 К-12, дефектные по И-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазе нлп глюкозамин-6-фосфатдезаминазе 148]. Рост бездеацети- 426 М-АЬ1А ФасФаралааабатис лерг ФФТС и Л.ГА 6-Ф и Аа А -6 - Ж беа чеюа юза лиеглаа4 ГА 6 Ф вЂ” Ф-6 Ф к МН„Гликалаз Гд 6 Ф де.аманата ГА 1-Ф дцеюал ад и АцГА-4 Ф ~-61Р 1ИР-М АЧГА ~- Ф611 'оау и-Лц' ал)куралкабая каслаюа полимеры аг юл аааараб б ялетаоггб спьнке Рис, 16.9.
Путь биосинтеза аминосахаров. М-АцГА— М-ацетилглюкозамин; ФФТС вЂ” фосфоенолпируват-фосфотрансферазная система; М-АцГА-6-Ф вЂ” М.ацетилглюкозамин-6-фосфат; ГА-б-Ф вЂ” глюкозамин-бфосфат; Фр-6-Ф вЂ” фруктозо- 6-фосфат; ГА-1-Ф вЂ” глюкоз- амин-1-фосфат; СоА — ко. фермент А; М-АцГА-1-Ф— М-ацетнлглюкозамин-1- фосфат, 11ТР— уридннтри. фосфат; 11ПР-М-АцГА— уридиндифосфат м-а|гетнлглюкоззмина, ФНП вЂ” фосфоенолпируват; 1ЛЗР-М-Ацетилмурамовая кислота— уридиндифосфат М-ацетил.
мурамовой кислоты. 18. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ лазного мутанта на среде, содержащей подходящий источник углерода и энергии (например, глюконат), в присутствии Х-ацетил- (1-1 4 С) -глюкозам ина приводит к накоплению Ь)-ацетилглюкозамин-б-фосфата, т. е. ассимиляция '"С отсутствует. Вместе с тем мутант, не содержащий дезаминазу, специфически включает метку в метаболиты пути биосинтсза аминосахаров. Эти мутанты уже были использованы в ряде экспериментов (12, !31, но возможности подобного способа введения метки в определенный путь метаболизма еще далеко не исчерпаны.
В ряде случаев успешно применяется метод быстрого отбора проб. Он оказался эффективным при изучении пути фиксации "СО, одноклеточными зелеными водорослями. С его помощью был обнаружен глиоксалатный цикл у Рзеиг(оглонаа и других организмов. Согласно этому методу, радиоактивную метку добавляют к клеткам на очень короткое время (секунды или минуты), а затем сразу же определяют меченые продукты. Для анализа путей метаболизма можно также использовать метод конкуренции изотопов. Этот метод основан на том, что при мечении всех компонентов, участвую1цих в определенном пути метаболизма, добавление немеченого компонента вызывает пропорциональное снижение удельной радиоактивности всех метаболитов начиная с добавленного. Робертс и др. [38) широко и успешно примепилн этот метод в своих классических исследованиях биосинтеза аминокислот у Е.
со(11 Метод радиореспироА4етрии, разработанный Уонгом 1471, относится к классу методов, с помощью которых можно измерять дыхательную активность биологической системы. С его помощью изучают скорость и степень превращения '4С-субстрата (иапример, 1-'4С-глюкозы, 3,4л4С-глюкозы или Р1-1-44С-глутамата) в СО,, выделяющийся при дыхании. Этот метод используется для анализа путей катаболического дыхания у дрожжей и различных бактерий, включая среди прочих Вгеп1Ьас1ег1ит, Аг!ЬгоЬас(ег, Хан!Ьотопаз, СогупеЬас1ег1ит, Ь4егззег1а и ЕзсЬег1с!11а.
Он широко применяется для определения потока углерода через взаимосвязанные пути, такие, как путь Эмбдена — Мейергофа — Парнаса, путь 427 ЧАСТЬ 1Ч МЕТАБОЛИЗМ Рис, !8.10. Конструкция радиореспирометрнческого устройства. Газ (например, азот или кислород) из резервуара под давлением (1) проходит через измеритель потока газа (2), с помошью которого регулируется постоянвая скорость прохождения газа через радпореспироме~рическую колбу (3). Эту колбу моткно изготовить нз 125 †2-мл колбы Эрленмейера.
Трубка лля ввода газа встроена в колбу таким образом, чтобы регулировалось давление, а постоянный поток газа переносил "СОз, образуемый в результате метаболизма, из колбы в трехходовой кран (4). Отсюда газ направляется в одну из двух ловушек для СОз (5). Сначала "СОх собирают в одну ловушку, а затем через определенное время кран поворачивают и '"СОз собирают во вторую ловушку.
К колбе (3) припаивают боковые отводы для добавления субстрата или отбора проб через резиновые пробки. На качалку в водяной бане (б) можно поместить по меньшей мере шесть таких сосудом для одновременного анализа. Энтнера — Дудорова, пентозофосфатный путь, путь глюкуроновой кислоты и цикл трикарбоновых кислот. Как н другие методы исследования, раднореспирометрия имеет определенные недостатки и ограничения. Как правило, он требует изготовления специального оборудования, которого нет в продаже. Его, впрочем, можно изготовить с минимальными затратами, как, например, в случае блока с шестью сосудамн, сделанного в моей лаборатории (рнс. 18.10). Стеклодув может легко превратить 250-мл колбы Эрленмейера в сосуды для радио- 428 14. эввмвитлтивиья лктивность респирометрии, а обычные хроматографические колонки — в устройства для улавливания СО,.
Список необходимого оборудования включает измеритель потока газа, термостатируемую качалку, штатив для укрепления измерителя потока и поглотителя СОм и жидкостный сциитнлляционный счетчик. Ограниченность использования этого метода обусловлена тем, что некоторые соединения, специфически меченные "С, которые могут потребоваться при проведении определенных работ, отсутствуют в продаже. Использование индииированнык ауксэгрофов Принципы, лежащие в основе применения ауксотрофпых мутантов для изучения различных метаболических путей, в частности путей биосннтеза, хорошо известны, а подробности отбора и использования таких мутантов описаны в другом разделе руководства (равд.
!3.6.2). Рассмотрим последовательность пути биосинтеза; в~ е~ ез е4 А —  — С вЂ” Π— Е, где Š— конечный продукт, необходимый для роста культуры. Любая мутация, влияющая на фермент Еь Ев Еь или Еь приведет к остановке роста культуры, если только не будет обеспечено поступление соответствующего метаболита из другого источника. Этот мета- болит, естественно, должен транспортироваться в клетки. Метаболиты, образующиеся перед поврежденной стадией, при наличии достаточных количеств ростовых субстратоа будут накапливаться в высоких концентрациях. Идентификация накапливающихся метаболитов н метаболнтов, стимулирующих рост мутантных клеток, наряду с соответствующими исследованиями фермента может дать существенную информацию о последовательности реакций данного пути метаболизма.
Такие методики с использованием мутантов с большим успехом применяются при изучении синтеза аминокислот с разьетвленной цепью, в том числе ароматических аминокислот. 429 ЧАСТЬ Нс МЕТАБОЛИЗМ 18.5.2. Баланс изотопного углерода Оби(ие замечания Представьте следующую гипотетическую ситуацию: вы выделяете культуру новой бактерии, о которой не знаете ничего, кроме того, что она растет в комплексной среде неопределенного состава, содержащей глюкозу.
Ваша задача — описать в общих чертах пути метаболизма этой бактерии. Как бы вы приступили к решению этой задачи? Прежде всего возникают вопросы: какие биоэнергетические пути использует бактерия; какое количество утлерода глюкозы ассимилируется при биосинтезе, если только это вообще имеет место; в какие макромолекулярные компоненты включается углерод? Чтобы справиться с поставленной задачей, потребуется ответить на все эти вопросы (как и иа многие другие, естественно). Экспериментальное определение раднонзотопного баланса служит серьезным фундаментом, на основе которого можно сделать попытку решить эту задачу.
Культуру выращивают в течение времени, достаточного для диссимнляции 30 — 707о добавляемой глюкозы, меченной '4С (равномерно или специфически в положениях С-1, С-3,4 нли С-6). В конце выращивания подводят баланс "С. Полученные при этом данные служат отправной точкой в определении путей метаболизма. Эксперимент такого рода можно успешно осуществить с культурами дикого штамма Е. ео(г' МЬ 30 следующим образом. Культуру Е.
со(1 в фазе экспоненциального роста переносят в радиореспирометрический сосуд (удобно использовать для этой цели 125-мл колбы Эрленмейера), устроенный таким образом, чтобы был возможен непрерывный ток газа ()ч(м Жз — СОМ воздуха, Оз и т. д.) и отбор образующегося 14СОЗ (рис. 18.10). Для добавления субстрата целесообразно снабдить колбы боковыми отводами (закрывающимися газонепроницаемыми пробками, например пробками от пенициллиновых флаконов). Если использовать сосуды с двумя газовыми ловушками, соединенными с помощью трехходового крана, МСОЗ можно отбирать во время опыта через определенные интервалы и использовать его в кинетических исследованиях, в частности, как описано Уонгом 1471 430 1к овпмвнтативная активность для анализа путей метаболизма с помощью радиореспирометрии. Клетки активно растущей культуры Е.
со!! собирают, промывают и ресуспендируют в свежей основной солевой среде (равд. !8.4.2), содержащей ХН~4, г!Н,г и гидролизат казеина или любой другой источник азота. Для таких быстро растущих культур, как Е. со!й в начале эксперимента достаточно 50 †1 мкг (сухой вес) клеток на 1 мл среды, для более медленно растущих организмов требуется ббльшая биомасса. Раствор "С-глюкозы (равномерно меченной с удельной активностью 10' имп/мин.мкмоль или выше) помещают в боковой отвод и вливают в сосуд с культурой (конечная концентрация 10 мМ), начиная тем самым эксперимент. Открывают систему газонаполнения, культуру встряхивают (можно поместить все устройство на лабораторную качалку с термостатируемой водяной баней) и начинают отбор газа в ловушки.
"СО2 собирают с помощью газоулавливающего раствора — смеси моноэтаноламипа и абсолютного этанола (1: 2; 10 мл). Газо- улавливающий раствор сливают с 20 — 30-мин интервалами из колонок, для изготовления которых достаточно иметь стеклянные хроматографические колонки с вплавленным в основание пористым стеклянным фильтром, снабженные отверстиями для ввода газа, как показано на рис. 18.10, и разбавляют абсолютным этанолом до 20 мл. Затем отбирают пробы и определяют радиоактивность (внеся соответствуюгцие поправки на тушение) с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика (равд.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
