Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 83
Текст из файла (страница 83)
16.4.3). Таким образом, подсчитывают общее количество "СО,, образующегося в результате метаболизма глюкозы. После 2 — 3 ч роста в культуру вливают Н230~ для остановки реакции и высвобождения растворенного "СО,. Пропускание газа продолжают в течение 15 мин, затем устройство демонтируют. После этого культуру обрабатывают описанным ниже способом. Определение неиспользованного субстрата Концентрацию глюкозы в начале н в конце периода роста культуры определяют с помощью любой стандартной методики.
Разность этих величин равна количеству 431 чхсть пи метлволизм глюкозы, потребленной клетками. Поскольку удельная радиоактивность глюкозы известна, можно вычислить процент суммарной активности культуры в минуту, приходящейся на неиспользованную глюкозу. Следовательно, остальная радиоактивность приходится на СОм не- газообразные конечные продукты и углерод, ассимилированный клетками.
Определение ассимилированного "С Готовят различныс разведения выше указанной культуры, фильтруют их через мембранные фильтры (с размером пор 0,45 мкм), промывают и затем измеряют общую радиоактивность, которая соответствует радиоактивному углероду, включенному в клетки. Можно также отобрать пробу шприцем до остановки роста культуры путем добавления Н,50„отцентрифугировать ее, промыть свежей средой и вновь отцентрифугировать. После этого осажденные клетки можно фракционировать для выявления распределения ыС между клеточными компонентами с помощью методики, описанной Робертсом и др.
~[38). Эта методика полезна при проведении многих исследований. Разработаны также ее модификации, которые в некоторых случаях могут быть более подходящими (разд. 17.1), Осадок клеток сначала суспендируют в 5 мл 5е7е-ной ТХУ и выдерживают 30 мин в ледяной бане. Отбирают аликвоты суспензии и определяют общую радиоактивность клеток. Затем суспензию центрифугируют и отделяют надосадочную фракцию. Измеряют радиоактивность этой фракции, которая растворима в холодной ТХУ, содержащей низкомолекулярные вещества.
Осадок ресуспендируют в 5 мл 75%-ного этанола, нагревают при 45'С в течение 30 мин и затем центрифугируют. Надосадочиую жидкость сливают и отбирают из нее аликвоту для измерения радиоактивности, присутствующей в спирторастворимой фракции. Осадок ресуспсндируют в 5 мл 7,5е(е-ной смеси этанола и диэтнлового эфира (1: 1), нагревают при 45'С в течение 30 мнн и центрифугнруют. Надосадочную жидкость сливают и определяют радиоактивность фракции, растворимой в смеси спирта и эфира. Эти две фракции !з.
ФегментАТНВИАя АкТиВЙОсТь содержат суммарные клеточные липиды и некоторые спирторастворимые белки. Осадок ресуспендируют в 57е-ной ТХУ, помещают в кипящую водяную баню на 30 мин и вновь центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и отбирают пробу этой фракции, растворимой в ТХУ (фракции нуклеиновых кислот), для определения радиоактивности. Осадочную фракцию, нерастворимую в горячей ТХУ (белки и клеточные стенки), ресуспендируют в 0,01 и. !чаОН н измеряют в ней радиоактивность.
С помощью этой методики определяют не только долю общей радиоактивности субстрата, ассимилированную клетками, но и устанавливают природу тех макромолекул, в которые включился изотоп. Определение негазообразных конечных продуктов (см. также разд. 16.3.1 и 16.3.4) Перед окончанием роста культуры отбирают 5 мл пробы (или больше) и добавляют к 5 мл смеси немечепых соединений, содержащей достаточное количество Н,504, так чтобы конечный рН был равен 1,5 — 1,8. При этом происходит остановка реакции и перевод всех присутствующих в среде метаболитов в кислотную форму.
Смесь немеченых соединений (при использовании Е. со- 1!) содержит следующие компоненты, растворенные в основной ростовой среде: этанол, уксусную кислоту, пировиноградную кислоту, муравьиную кислоту, фумаровую кислоту, молочную кислоту, янтарную кислоту и лимонную кислоту. Ввиду малых количеств конечных продуктов в 5 — 10 мл культуральной среды использование смеси немечеиых соединений существенно для получения количественного выхода радиоактивных конечных продуктов, образуемых клетками. Концентрация каждого компонента смеси равна О,! М, за исключением фумаровой кислоты, концентрация которой составляет 0,05 М.
Смесь немеченых соединений вместе с культурой центрпфугнруют для удаления клеток. Надосадочную жидкость отделяют и хранят до анализа в замороженном состоянии. При исследовании разных организмов требуется приготовление смесей различных немеченых соединений. Их состав, естественно, зависит от природы ко- 433 ЧАСТЬ 4Ч МЕТАБОЛИЗМ печных продуктов, которые должны накапливаться в культуральной жидкости. Нсгазообразные конечные продукты, присутствующие в 1 мл такой пробы, определяют с помощью хроматографии на кремневой кислоте следующим образом, 1 мл пробы смешивают с 1,8 г сухой кремневой кислоты (хроматографической степени чистоты), смесь вносят в верхнюю часть колонки с 5 мл бензола.
Для набивки колонки смешивают 10 г кремневой кислоты с 6,5 мл 0,5 и. НТ504 до сыпучего состояния. Добавляют бензол для получения суспензии, которую вливают в колонку, а затем ее промывают бензолом. Колонку набивают под давлением 0,9 кг/м', следя за тем, чтобы материал насадки нс подсыхал и не отделялся от стенок колонки. (Осторожно) Бензол обладает слабым канцерогенным действием.) Через колонку пропускают 50 мл хлороформа, а затем 600 мл градиентной смеси, которую готовят следующим образом. В смеситель наливают 300 мл хлороформа, а в резервуар 300 мл 5% -ного раствора трет-бутанола в хлороформе.
После окончания элюирования добавляют еще 50 мл 5%-ного грет-бутанола в хлороформе, а затем 100 мл 10%-ного грег-бутанола в хлороформе. Все растворители пропускают через колонку со скоростью 2 мл/мин с помощью насоса. Предварительно их обрабатывают 20 мл 0,5 н. Н4504 (на 1 л растворителя) в делительной воронке, затем «высушнваютз, фильтруя через два слоя сухой фильтровальной бумаги (не допуская, чтобы водный слой проходил через фильтр). Фракции по 10 мл собирают с помощью сифона и автоматического коллектора фракций. Из каждой фракции отбирают определенный объем и вносят в флаконы для сцинтилляционного счетчика.
Радиоактивность измеряют в соответствующих смесях нли жидкостях. Необходимо помнить о поправке на тушение сцинтилляции (за счет хлороформа), которое может иметь место (равд. 16.4.3). Пробы с известным содержанием "С-этанола, -ацетата, -пирувата, -формиата, -лактата и -сукцината обрабатывают, как описано выше,для определения последовательности их элюирования и процента выхода. Во всех случаях выход составляет в основном 18 ФНРМННТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ с х 'го в н чч ГО ч а О 80 гО 50 40 50 50 70 Номер горсмчик Рнс. 18.11, 11егазообразные конечные продукты аназробного метаболизма равномерно меченной мС-глюкозы у Е. согй разделенные методом хроматографии на кремневой кислоте.
Радиоактивность измерялн в сцинтнлляционном счетчике. 100о78 с учетом всех поправок и при постановке необходимых контрольных проб. Типичная картина хроматографического распределения негазообразных продуктов, образуемых в клетках Е. 0011 МЬ 30 в анаэробных условиях в присутствии "С-глюкозы и определенных, как описано выше, представлена на рис. 18.11. Расчет и определение баланса Подсчитав обшую радиоактивность, связанную с каждым из описанных выше этапов, можно представить общую картину и определить некоторые метаболические пути, которые либо используются, либо не используются в данных условиях роста.
В конце периода роста бактерий вся исходная радиоактивность( )свох) должна быть Равна сУмме Радиоактивностей неиспользованного с1бстрата (8.), газообразных конечных продуктов (б), ассимилированного углерода (А) и негазообразных конечных продуктов (Е), 435 ЧАСТЬ ЪЧ. МЕТАБОЛИЗМ Если это не соблюдается, то возможна какая-либо экспериментальная ошибка. Общая радиоактивность, присутствующая в культуре в конце периода роста, равна сумме всех этих радиоактивностей, за исключением радиоактивности углерода в газообразных продуктах (К„, †или 8,+А+Е). Если все клетки удаляют центрифугированнем в конце периода роста, то общая радиоактивность надосадочиой фракции представляет собой лишь сумму радиоактивностей неиспользованного субстрата (5„) и негазообразных конечных продуктов (Е).
Величина Е равна сумме всех веществ, элюированных из колонки с кремневой кислотой. Если это не так, то не исключено, что в растворс присутствует конечный продукт, не обнаружпваемый в указанных условиях. Установив балансовые взаимоотношения и определив путь превращений углерода, можно сделать некоторые общие заключения, касающиеся биоэнергетнческих н бносинтетических путей метаболизма. Например, появление радиоактивности в клеточной фракции, не растворимой в горячей ТХУ, означает участие меченого субстрата в биосинтезе аминокислот или реакциях биосинтеза клеточных стенок. Природа образующихся газообразных и негазообразных конечных продуктов и их соотношение могут служить ключом к определению типов биоэнсргетических путей, используемых в условиях роста, применявшихся в эксперименте.
Проводя подобные исследования в изменяющихся условиях роста бактерий (в аэробных и анаэробных, на богатой и бедной среде, в присутствии и в отсутствие различных ингибиторов и т, д.), можно получить дополнительные сведения в этом отношении. 18.5.3. Наличие ключевых ферментов Другой необходимый этап работы, направленный на выявление какого-либо пути метаболизма, заключается в определении тех ферментов, которые отличают один путь от другого, т.
е, являются ключевыми ферментами того нли щюго пути метаболизма. Разработаны методики определения ключевых ферментов, участвующих во многих классических путях диссимиляции углеводоВ, !8. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ Таблица 18.3. Ключевые ферменты основвык путей метаболизма Иоточ- ввк Путь метаболизма Ключевые ферменты Канавы, фруктово-1,6-бнсфосфат- альдолаза 1501 Путь Эмбдена — Мейергофа — Парнаса (глнколнтнческнй путь) Гексозомонофосфатный н пентозофосфатный пути Фосфокетолазный путь Путь Энтнера — Дудорова Прямое окисление Глюкозо-6-фосфат - дегндрогеназа, трансальдолаза, транскетолаза Фосфокетолаза Фосфо-2-кето-3-дезокснглюконат — альдолаза Глюкозо- н глюконатдегндрогеназы Цгттрат-сннтазз, цнтрат — оксалацетат-лназа, аконнтат-гндратаза, нзоцнтратдегндрогеназа, оксалсукцннатдекарбокснлазз, а-кетоглутаратдегндрогеназа, лнпонлредуктазотранссукцнннлаза, лнпоамнд.дегвдрогеназа (гчАР+), сукцнннл-СоА — сннтетаза, сукцнннл.СоЛ вЂ” гндролаза, фумарат-гндратаза, малатдегндрогеназа, нзоцнтрат-лназа, малатсннтаза, система пнрувзтдегндрогеназы Разлзтчные карбокснлазы, декарбокснлазы и т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
