Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 87
Текст из файла (страница 87)
!9. ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ТРАНСПОРТ Кроме того, часто можно останавливать транспортные реакции, помещая пробы в лед или в охлажденный до температуры льда буфер. Последующее центрифугирование проводят на холоду.,Для успешного применения этой методики необходимо, чтобы охлаждение приостанавливало процесс поглощения, но не вызывало выхода веществ из клетки. Такая процедура дает хорошие результаты чаще с грамположитсльными, чем с грамотрицательными бактериями. В некоторых случаях нет необходимости отделять клетки от раствора. Например, ионселективные электроды позволяют вести непрерывное наблюдение за рН, парциальным давлением кислорода (р09), содержанием ионов калия и т.
п. (равд. 16.2). Более того, при изучении поглощения солей часто достаточно бывает лишь следить за изменением проводимости суспендирующей среды с помощью обычной кондуктометрической ячейки. 4, Отмывка клеток Клетки, остающиеся на фильтре, обычно необходимо промыть для удаления компонентов среды с их поверхности. Промывная жидкость должна быть осмотически забуференной, особенно для грамотрицательных бактерий, так как транспортные системы чувствительны к осмотическому давлешпо. Для промывания часто используются концентрированные растворы сахаров (например, 0,5 М раствор сахаровы). Можно также добавлять ионы марганца (обычно 50 мМ) в виде хлорида или сульфата. Идеальный промывной раствор должен в основном удалять исследуемое вещество из осадка клеток и фильтра при первом же промывании.
Однакв обычно приходится идти на определенный компромисс (дополнительные сведения см. в равд. 19.1.1). Иногда можно избежать необходимости промывания клеток, центрифугируя их через слой жидких силиконов, как описано Гурвицем и др.~~17]. Клетки проходят через силикон и образуют осадок, не содержащий межклеточной воды.
Немного воды может остаться на поверхности клеток, и вода клеточных стенок также не удаляется. 453 часть 1у. метлволизм 5, Удаление клеток и их анализ ни содерлсание исследуемого ееи1естеа Клетки можно элюировать с фильтра, ресуспендировать до известного объема и определять содержание в них изучаемого вещества химическим (гл. 17) или радиометрическим способом (равд.
16А). При использовании радиоактивных растворенных веществ чаще всего фильтры высушивают и помещают прямо в сциптилляцпонную жидкость для счета импульсов. Можно также определить количество растворенного вещества, включенного в основные биополимеры, обработав клетки на фильтре охлажденным раствором ТХУ (равд. 17.1) и промыв затем водой перед высушиванием. Удобно пользоваться фильтрами, растворяющимися в сцинтилляционной жидкости или в растворителе, смешивающемся с этой жидкостью.
Подробно об этом можно прочитать в проспектах фирм или статьях по сцинтилляционному счету. Мембранные фильтры могут связывать изучаемые растворенные вещества, особенно ионизованныс, и тогда нужно вносить соответствующую поправку. Степень связывания можно установить, пропустив через фильтр часть испытуемого раствора без клеток, промыв его так, как если бы в нем находились клетки, и определив количество растворенного вещества, задержанного фильтром.
19.2.2. Выражение результатов Поглощение или выход веществ обычно выражают в пересчете на единицу веса или объема клеток или обьсма клеточной воды. Результаты исследования транспортных процессов можно также относить к одной клетке, что позволяет сравнивать способность различных клеток к транспорту. Чаще всего пользуются пересчетом на клеточную воду. Полезно также определить соотношение концентраций испытуемого растворенного вещества внутри клетки и в суспендирующей среде, чтобы выяснить, имел ли место концентрирующий транспорт. 454 19. ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ТРАНСПОРТ Рнс.
19.2. Графическая опенка вклада диффузии в общее поглощение растворенного вещества бактериальиыми клетками. Поглощение, обусловленное транспортом, равно разности между об- ~- щим и пассивным поглоще- й нием. Его можно измерять Ъ либо скоростью пропесса, ~ либо общим количеством поглощенного вещества. Ваг "аа"о мал аоаагагаоани а ра""оогг;юоо божее"аба При использовании растворенных веществ с радиоактивной меткой весьма желательно переводить результаты счета импульсов в молярные единицы. Транспортные процессы обычно рассматривают как подклассы реакций, катализируемых ферментами, поэтому здесь применимы принципы и методы изучения ферментативной кинетики.
Например, график двойных обратных координат Лайнуивера — Бэрка, отражающий зависимость величины, обратной скорости транспорта, от величины, обратной концентрации растворенного вещества, часто представляют собой прямые линии, позволяющие вычислить значения Км (константы Михаэлиса) и )г .„(максимальной скорости). Конкретный пример можно найти в работе Эймса [11.
Можно также построить кривые Эди — Хофсти, отражающие отношение скорости транспорта к скорости, деленной на концентрацию субстрата. Затруднения, возникающие при исследовании кинетики ферментов, встречаются и при изучении транспорта. Нередко у клеток имеется не одна транспортная система для данного растворенного вещества. Например, многие бактерии обладают высокоаффинной транспортной системой, весьма специфичной для какой-то одной ароматической аминокислоты, а также намного менее специфичной низкоаффинной системой.
Методы изучения активности таких множественных систем описаны Эймсом ~1). Многие растворенные вегцсства могут проникать в клетки как пассивно, путем диффузии, так и в резуль- 455 ЧАСТЫЧ. МЕТАБОЛИЗМ тате активного транспорта. При высоких концентрациях субстрата диффузионные процессы обычно не приводят к насыщению; их вклад можно оценить по графику типа представленного на рис. 19.2. Если клетки интактны, процесс диффузии может включать диффузию растворенного вещества в воду клеточной стенки 1291, которая у таких организмов, как М(сгососсиз (узог1ей1(сиз (М. 1иГепз), может составлять около 50% объема клетки. 19.2.3. Общие замечания Главное преимушество использования разбавленных клеточных суспензий — легкость получения данных по кинетпке.
Кроме того, в таких суспензиях легче контролировать рОМ рН, ионную силу и т. п., а также поддер>кивать почти постоянную концентрацию растворенного ве>цества в суспендируюшей среде. Однако этот подход не лишен недостатков. К ним относятся трудности, связанные с выходом растворенного вещества из клеток во время первичного суспендирования или промывания; необходимость определить поглощение или потери растворенного вещества путем измерения его внутриклеточной, а не внеклеточной концентрации; и наконец, то, что в разбавленных суспензиях клетки могут быть весьма чувствительны к изменениям условий среды.
19.3. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ 19.3.1. Протонодвижущая сила Протонодвижушую силу считают одним из основных средств преобразования и переноса энергии в биологических системах [31). Ее определяют как Лр = Лф — 2,3 — (ЛрН), где Лр — протонодвижущая сила, Л ф — мембранный потенциал, >т — газовая постоянная, Т вЂ” температура по Кельвину, Р— число Фарадея и ЛрН вЂ” разность рН внутри и вне клетки.
При температуре около 25'С ве- !9. ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ТРАНСПОРТ личина 2,3 ттТ~Е (часто обозначаемая г) составляет 59 мВ. Таким образом, для определения Лр необходимо независимо определить Лф и ЛрН. Методы определения Лтр обычно включают в себя оценку распределения какого-либо яона, который свободно проходит через клеточную мембрану.
Например, Харольд и Альтендорф !161 предложили использовать для вычисления Лтр распределение хлорид-иона. Величина Лф в этом случае равна 2~ ЖТ) Р !!ОЯ (С1нннщнИС1ннттр) 1' где (С1„, „) и (С!ннтнр) — концентрации хлорид-иона вне и внутри клетки. Этн концентрации можно определять с помощью метода занимаемого пространства или его вариантов. В действительности следовало бы вместо концентраций хлорнда использовать его активность, но определить коэффициент активности хлорида внутри клетки невозможно; он, вероятно, лишь ненамного ниже 1,0, так что активность и концентрация не сильно различаются.
Активность хлорида можно определить с помощью хлоридного электрода (Ог!оп Кезеагс!т, 1пс., СатЬТ)бпе, Маза.), а концентрацию — химическим методом (40) . Харольд и Альтепдорф 1161 указывают, что хороший индикатор Лнр должен «быстро диффундировать через мембрану... быть полностью диссоциированным при физиологических значениях рН, не нарушать процессов метаболизма и не подвергаться траислокации системами биологического транспорта», Этим требованиям может удовлетворять Кэ в клетках, обработанных 1 — 10 мкМ валиномицином с целью сделать мембрану проницаемой для этого иона.
Поскольку мембранный потенциал у бактериальных клеток обычно составляет около 180 мВ с отрицательным полюсом внутри, концентрация калия в цитоплазме клеток, обработанных валиномицином, примерно в 20 раз больше, чем в суспендирующей среде. Концентрацию калия можно определить с помощью атомно-абсорбционной спектрофотометрии, пламенной фотометрии или — менее точно — ионселективного электрода (разд. 16.2.2). Поглогцение К+ измеряют методом занимаемого объема (или используют одну из его модификаций), а концентрацию вычисляют, исходя из чйсть 1ч.
метаволизм числа молей Ко., поглощаемых на единицу объема клеточной воды, Величину Лф можно также оценить по распределению проникающих органических катионов или с помощью флуоресцентных красителей. Подробно зто описано в статье Мэлони и др. [3). В качестве проникающего авиона широко применяется тиоцианат, особенно с тех пор как он стал доступен в форме, меченной "С; пример описан в статье Соргато и др.~[42).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
