Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 88
Текст из файла (страница 88)
Для определения ЛрН используют слабую кислоту или основание, которые могут проникать в клетку. Выбранное соединение должно днссоциировать при физиологических значениях рН так, чтобы его распределение между клеткой и внсклеточной средой зависело от разности рН обеих фаз.
Клеточная мембрана должна быть проницаемой для недиссоциировавшей формы и непроницаемой для ионизированной формы. Для определения ЛрН обычно используют ацетат, диметилсульфокснд, метиламин и салицилат. Рассмотрим уравнение Гандерсона — Хассельбаха для слабой кислоты, Пусть А — анианная форма, НА — неднссоциировавшая форма, а индексы ! и о означают концентрацию соответственно внутри и вне клетки. Тогда рН! = рК; + !ох[Ао]/[НА;[! рНо = рКо+!Пя[Ао[ДНАо].
Обычно считают, что рК;=рК„и поскольку мембрана проницаема для нсдиссоциированной формы, то [НА,) = [НА,). Следовательно, рНо рНо =!ся[А![/[НАо[ !оя[Ао]/[НАо[ = = !ох[А;]ДнА;] + 1од[нАо[/[Ао[ = =!ов []А!1/[НА;[оС[НА,1ДА,]], ЛрН = ]од [А,.[/[Ао[. Значение ЛрН можно, таким образом, оценить по распределению, например, ацетата между клетками и суспендирующей средой с помощью описанной выше методики анализа проницаемости.
Из наружной концентрации ацетата и рН можно вычислить наружную концентрацию НА, равную внутренней. Внутренняя концентрация А равна разности между общей внутренней 458 ~к пгоницлвмость и тплнспопт концентрацией ацетата и концентрацией НА. Зная соотношение 1А )/[НА;) и значение рКь можно найти внутриклеточный рН с помощью уравнения Гендерсона — Хассельбаха. Метод занимаемого объема позволяет также определить поглощение веществ — индикаторов рН. Кроме того, можно применять методы, не требующие больших количеств клеток, если для определения нецитоплазматической воды используется какое-нибудь не проникающее в клетку соединение. Например, в статье Мэлони и др. 13) на стр. 29 приводится пример определения нецитоплазматической воды в суспензии клеток 51гер1ососсиэ 1ас11з с помощью 'Н-сорбитола с использованием ыС-диметилсульфоксида как индикатора рН. Следует помнить, что определение ЛрН и Лф в значительной мере опирается на расчеты и что существуют трудности, связанные со специфическим н неспецифическим связыванием заряженных частиц биополимерамн, Однако часто важно бывает узнать не абсолютные значения ЛрН или Лф, а нх изменения.
Рамос и сотр. 135, 36) разработали н подробно описали метод проточного диализа, не требующий разделения клеток и суспендирующей среды. Этот метод особенно полезен при исследовании мембранных везикул. В последние годы разработаны методики 133) для определения внутриклеточного рН у бактерий с помощью ядерного магнитного резонанса. Можно также определять рНь используя флуоресцентные красители, такие, как пирамин 120].
Зная рНь легко определить рН, с помощью стеклянного электрода и затем вычислить ЛрН. 19.3.2. Осмотически чувствительные клетки Поглощение клеткой растворенного вещества приводит к снижению активности воды внутри клетки и последующему притоку воды извне, в результате чего клетка набухает. Биологические мембраны хорошо пропускают воду, и набухание происходит чрезвычайно быстро. Например, Мэттс и Ноулз 130) методом остановленной струи установили, что осмотический выход воды из ядств тч. Мвтьволизм Рнс. 1Э.З. Осмотические иаменення объема бактериальных клеток. Прерывистая линия — идеальное поведение в соответствии с уравнением Вант-Гоффа — Бойля. Сплошная линии — реальное поведение.
а Е $ и \ й ьь осмсляльнссмь ' клеток Е. соИ, помещенных в 0,4 М раствор МаС!а, завершается при 37'С за 50 мс. Поскольку движение воды столь стремительно, скорость набухания, сопровождающего поглощение растворенного вещества, можно связать непосредственно со скоростью транспорта. Нужно, однако, подходить к этому с некоторой осторожностью, особенно в отношении тех бактсриальных клеток, стенки которых достаточно эластичны, чтобы сопротивляться набуханию. (Да, именно эластичностьь а не жесткость, как обычно предполагают, противостоит набухапию. Физические свойства бактериальных клеточных стенок рассматриваются в обзоре Роджерса 138).) Набухание и сжатие идеального осмометра можно предсказать с помощью уравнения Вант-Гоффа †Бой У вЂ” Ь= а/П, где У вЂ” общий объем клетки, Ь вЂ” так называемый осмотически мертвый объем (который обычно приблизительно равен вычисленному объему сухого вещества клетки), а — константа (число осмолей в клетке) и П вЂ” осмоляльность суспендируютцей среды.
График зависимости У от 1/П для идеального осмометра представляет собой прямую линию с пересечением оси у в точке Ь и наклоном а, тогда как действительное поведение бактериальных клеток описывается кривой (рис. 19.3). Очевидно, что бактерии не являются идеальными осмометр ами. 19. ЛРОННЦАВМОСТЬ И ТРАНСПОРТ Реакция на изменение осмоса заметно снижается в средах с высокой осмоляльностью, и экспериментально определяемое значение О можно получить только путем экстраполяции. Причины аномального поведения в концентрированных средах неизвестны. Оно может быть обусловлено связыванием воды и загустенисм цитоплазмы или же снижением проницаемости для воды.
В разбавленных средах бактериальпые клетки резистентны к осмотическому набуханию в основном благодаря эластичности их стенок. В концентрированных же средах они подвергаются плазмолизу, т. е. протопласт сжимается так, что мембрана отстает от стенки и между стенкой и мембраной протопласта образуются плазмолизные вакуоли. Их часто можно увидеть под микроскопом, особенно у грамотрицательных бактерий. Но даже если они не видны под микроскопом, их присутствие можно выявить путем измерения проницаемости.
Можно, например, определить общий объем как пространство, непроницаемое для декстрана. Объем протопласта примерно равен объему, непроницаемому для рафипозы в условиях, когда рафиноза не проникает через мембрану протопласта. Тогда суммарный объем воды и клеточной стенке и плазмолизных вакуолях равен разности между объемами, непроницаемыми для декстрана и для рафинозы. Объем, занимаемый водой в клеточной стенке, можно оценить по величине объема, доступного для рафинозы, в набухших, неплазмолизированных клетках. Если плазмолизированные клетки вновь поместить в более разбавленную среду, то вода поступит в прото- пласт через водопроницаемую мембрану и протопласт набухнет; он займет пространство, ранее занятое плаз.
молизными вакуолями, и оптическая плотность суспензии возрастет. Между объемом протопласта и величиной, обратной оптической плотности, существует прямая зависимость ~27]. Когда протопласт только начинает набухать, сопротивление набуханию незначительно и процесс протекает почти идеально, т. е. подчиняется уравнению Вант-Гоффа †Вой. Но когда протопласт смыкается с клеточной стенкой, се эластичность препятствует дальнейшему набуханию, и это приводит к существенному отклонению от идеального процесса. Те- 461 ЧАСТЬ ПЛ МЕТАБОЛИЗМ перь прн поглощении воды возрастает объем не только протопласта, но и всей клетки, так что клеточная стенка растягивается.
Излом кривой зависимости г' от 1/П происходит в так называемой точке начала плазмолиза. Дальнейшее снижение осмоляльности среды приводит к возникновению н нарастанию тургорного давления. Предполагается, что осмоляльность среды в точке начала плазмолиза приблизительно равна внутренней осмоляльности клетки (это состояние для растительных клеток рассматривал Стеделман 16) ). Внутреннюю осмоляльность можно также определить, зная константу а (число идеальных молярных эквивалентов внутри клетки) и объем прото- пласта.
Результаты, полученные двумя этими способамн, обычно достаточно хорошо согласуются, Эластичность клеточной стенки не влияет на набухание выделенных протопластов, часто используемых в работах по транспорту, и, по-видимому, мало влияет на сферопласты, у которых сохраняются остатки стенок. Если, однако, протопласты заставить набухать медленно, так чтобы нх мембраны не разрывались, мембрана может стать упругой н степень набухания нельзя будет предсказать с помощью уравнения Вант-Гоффа — БойлЯ 127). Как уже упоминалось, величина, обратная оптической плотности, может служить показателем клеточного объема и, следовательно, поглощения растворенного вещества, хотя, конечно, следует всегда помнить, что на самом деле в таких опытах наблюдают за перемещением воды.
Важно также знать, что оптическая плотность зависит от разницы показателей преломления клетки и суспендирующей среды и что может потребоваться внесение поправок на изменение показателя преломления среды в результате повышения или понижения копцен1- рации растворенного вещества, В идеале желательно было бы иметь суспендирующую среду с изменяющейся концентрацией растворенного вещества, но постоянным показателем преломления.
Нередко при изучении поглощения растворенных веществ наружная концентрация изменяется незначительно, п поэтому поправок не требуется. Однако при изучении изменений осмотического РЬ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ТРАНСПОРТ объема концентрации, как правило, сильно варьируют. У солевых растворов показатель преломления при изменениях концентрации растворенных веществ изменяется меньше, чем у растворов сахаров. Однако в обоих случаях может потребоваться поправка величины мутности на изменение показателя преломления. Целесообразно иметь растворы полимерных декстранов, сильно различающиеся по показателю преломления, но с низкой осмоляльностью. Тогда можно было бы, например, приготовить концентрированный раствор сахаровы с высоким показателем преломления и высокой осмоляльностью и раствор декстрана Т2000 с таким же показателем преломления, но почти нулевой осмоляльностью.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
