Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 85
Текст из файла (страница 85)
Получение такого количества клеток может представлять проблему, однако не слишком слохсную при использовании обычных лабораторных культур. Методы, требующие меньшего количества клеток и основанные на применении мембранных фильтров пли мини-центрифуги, описаны в разделе о транспорте 1разд. 19.2), В любом случае следует уделять внимание деталям, касающимся выращивания и сбора клеток, так как проницаемость бактерий может сильно изменяться в течение цикла развития периодической культуры или в результате отмывания клеток от компонентов среды.
Часто удобнее использовать клетки, полученные в результате непрерывного культивирования. Изменения среды, ее температуры, рН и т. д. тоже могут приводить к изменению проницаемости. Объемный способ предназначен специально для того, чтобы определять, в какую долю объема (пространства) клеток может проникать изучаемое растворенное вещество. Этот метод основан просто на оценке степени разбавления раствора этого вещества после смешивания его с клетками, осажденными центрифугированием. Необходимы следующие данные: начальный объем и начальная концентрация изучаемого раствора; объем осажденных клеток; конечная концентрация растворенного вещества во внеклеточной фазе смеси осадка и раствора.
Клеточный осадок состоит не только из клеток, но и из межклеточного пространства. Объемную долю межклеточного пространства обычно определяют с помощью растворимых высокомолекулярных полимеров, способных проникать в межклеточное пространство, но не в клетки. Ниже приводится поэтапное описание методики, 1. Отмывание клеток Перед определением проницаемости собранные клетки необходимо отмыть. Однократное промывание большим количеством жидкости обычно позволяет в основ- 442 кс пгоницлвыость и телнспогт ном отмыть клетки от компонентов среды, но не удаляет из ннх в достаточной мере внутренние растворенные вещества. Часто требуется двукратное отмывание, трехкратное же вряд лн оправданно. Клетки многих бактерий, особенно грамположнтельных, достаточно устойчивы н не подвергаются существенному повреждению при отмывании водой илн разбавленными буферными растворамн, в особенности охлажденными.
Однако многие бактерии — прежде всего грамотрнцательные — гораздо чувствительнее, н промывание водой может привести к сильному повреждению клеток. К тому же при отмывании клеток грамотрнцательных и некоторых грамположительных бактерий часто наиболее эффективны теплые, а не охлажденные жидкости. Растворы, чаще всего применяемые для отмывания грамотрицательных бактерий, содержат ионы магния (обычно 50 мМ), буфер (например, 50 мМ фосфатный буфер нли трис-буфер) и осмотнческнй стабилизатор (например, 0,4 М 5)аС! илн 0,5 М сахарову). Маланя и др. 13) рекомендуют отмывать клетки ЕеепегЫча со(1 ростовой средой 63, не содержащей, однако, источника углерода.
Прн работе с ранее не использовавшимися бактериями целесообразно методом проб подобрать наилучший раствор. Критерием эффективности служит удаление компонентов среды прн сохранении внутриклеточных пулов калия, аминокислот или неорганического фосфата. Идеального промывного раствора не существует, н обычно приходится идти на некоторый компромисс.
Если для определения проницаемости используют густые клеточные суспензии, состав промывной жидкости (и суспензионной среды) не так важен, как в случае применения разбавленных суспензий для анализа транспорта. (См. также равд. 10.4.2 и 25.1.) 2. ((ентрифугироеание клеток После отмывания клетки центрнфугируют для получения достаточно плотного осадка. Режим центрифугировання зависит от конкретной культуры. В опытах с рядом клеточных суспензий получают кривую формирования осадка (вроде изображенной на рис.
19.1), откладывая вес осадка против времени центрифугнровання, ЧАСТЬ 1Я МЕТАБОЛИЗМ Зрела уггггрггугугадугануу— Рнс. 19Л. Типичная кривая об рааовання осадка клеток. 3. Измерение веса и объема осадка Вес влажного осадка обычно служит достаточно точным показателем его объема, и в расчетах им можно заменить объем, так как плотность влажных вегетативных бактериальных клеток обычно составляет около 1,02— 1,04 г/мл.
Однако влажные споры бактерий имеют значительно большую плотность (например, 1,22 г/мл у спор Вас111из з/еагоЯегторЫ!из), и вес осадка уже не будет эквивалентен объему. Некоторые включения (например, гранулы поли р-гидроксибутнрата) вегетативных клеток также имеют относительно высокую плотность во влажном состоянии, что может значительно увеличить разницу между весом и объемом осадка. 444 При подготовке суспензии для исследования проницае- ! мости клетки нужно центрифугировать значительно дольше того времени, при котором начинается горизонтальный участок кривой, чтобы небольшие отклонения во времени центрифугирования не влияли на вес осадка.
Последнее центрифугирование перед добавлением растворенного вещества обычно проводят в тарированной центрифужпой пробирке, для того чтобы можно было определить вес осадка, Пробирки с номинальной емкостью 50 мл наиболее удобны для сбора осадков весом около 10 г (во влажном состоянии), а 15-мл пробирки хороши для осадков весом около 3 г. Для рутинных анализов достаточна точность взвешивания до 0,01 г. Перед взвешиванием осторожно сливают падосадочиую жидкость, переворачивают пробирки для максимального и одинакового слива, а избыток влаги внутри пробирок удаляют впитывающей воду тканью. Однако не следует пытаться промокнуть воду с осадка, так как вместе с водой можно удалить и часть клеток.
19. ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ТРАНСПОРТ Объем осадка можно легко определить с помощью стандартного пикнометра или мерной колбы. Пусть, например, нужно измерить объем клеточного осадка весом около 3 г. Тогда осадок можно смешать с водой и перенести в 50-мл тарированный пикнометрический сосуд или мерную колбу, а затем довести до нужного объема водой. Допустим, что вес суспензии, определенный с помощью аналитических весов, равен 50,110 г (вес смеси н пикнометра минус вес пикнометра), а откалиброванный объем пикнометра равен точно 50,000 мл прн 25'С (температура взвешивания).
Предположим также, что вес осадка, найденный с помощью аналитических весов, составляет ровно 3,000 г. Тогда вес воды, добавленной к осадку, должен быть равен (50,110 — 3,000) г, т. е. 47,110 г. При 25'С такой вес воды занял бы объем 47,249 мл, что можно определить по плотности воды при этой температуре, указанной в стандартных химических справочниках. Следовательно, объем осадка равен 50,000 — 47,249, или 2,751 мл. Тогда плотность составит 3,000 г(2,751 мл, или 1,090 г/мл. При известной плотности и стандартных условиях центрифугирования можно легко вычислить объем осадка по его весу.
Объем осадка можно также определить непосредственно в тарированной центрифужной пробирке, закрытой покровным стеклом известного веса [101. Бортики стеклянной пробирки необходимо плоско сточить, поликарбонатные же пробирки изготавливаются с плоскими краями. 061ций объем пробирки определяют, заполнив ее дистиллированной водой и закрыв покровным стеклом (при этом не должно быть пузырьков воздуха в пробирке нли воды на ее наружной поверхности). Определив вес воды в пробирке, находят объем последней по плотности воды при данной температуре. Объемы осадков определяли также непосредственно, используя тарированную центрнфужную пробирку [12], что дает цитокрнтные данные, эквивалентные гематокритным, получаемым в повседневной гематологической практике. Этот цнтокритный метод позволяет получать полезные оценки объема, однако на практике он связан с некоторыми трудностями.
ЧАСТЬ ПА МЕТАБОЛИЗМ 4. Смешивание клеток с раствором и инкубирование Клеточный осадок, используемый для определения проницаемости, доводят до нужной температуры и смешивают с раствором изучаемого вещества при помощи стеклянной яли покрытой тефлоном палочки, не адсорбирующей жидкость: объем раствора должен быть примерно равен объему осадка.
Желательно получить достаточное разбавление, чтобы можно было легко определить разницу концентраций. После перемешнвания осадка и раствора суспензию инкубируют в течение известного времени при температуре эксперимента, чтобы могло установиться диффузионное равновесие, — обычно от 15 мин до 1 ч. Лучше всего убедиться, что равновесие действительно устанавливается в течение принятого времени ннкубации; для этого проводят опыты с различными осадками и разными периодами инкубации. б.
Повторное центри4угирование После инкубацни каждую смесь осадка с испытуемым раствором центрифугируют в течение достаточного времени, чтобы получить для анализа надосадочную жидкость без клеток. Может потребоваться ее дополнительное центрифугирование для осветления. б.
Определение концентраций растворенного вещества Концентрации растворенного вещества следует определять и в исходном растворе, который смешивают с клеточным осадком, и в конечном, полученном после повторного центрифугурования. Обычно для этого можно брать небольшие пробы и использовать гравиметрический или рефрактометрический метод. Однако эти методы иеспецифичны, и поэтому примесь других веществ, специально добавляемых к суспензии или переходящих в нее из клеток, может создать помехи.
В этом случае применяют более специфические химические или радионзотопные методы. НЬ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ТРАНСПОРТ 19.1.2. Определение межклеточного пространства Для того чтобы вычислить объем клеток, доступных для проникновения испытуемого вещества, нужно узнать объем межклеточного пространства в осадке. Соответственно один осадок из каждой опытной серии следует смешать с раствором высокомолекулярного полимера, все молекулы которого слишком велики, чтобы пройти через клеточные стенки, и попадают лишь в межклеточное пространство.
Лучше всего для этой цели подходит препарат декстрана со средней мол. массой 2000000 (Рех!Тап Т2000, Рйагшас!а Р!Пе Спеш!Са1з, 1пс., Р(зса!ацау, Хек,!егзеу). Декстраны полидисперсны, но даже наименьшие молекулы столь высокомолекулярного препарата не проходят через клеточные стенки бактерий [41!. Концентрацию декстрана обычно определяют методами гравиметрии или рефрактометрии либо химическим методом — с помощью фенола и серной кислоты 1!3). Но эти методы не специфичны в отношении декстрана, и определению могут мешать другие вещества, специально добавленные в среду или перешедшие в нее из клеток.
Было бы удобно использовать декстраны с радиоактивной меткой, но средняя молекулярная масса самых крупных из коммерчески доступных меченых дек. странов (например, поставляемых фирмой Иетч Епд!апй Хцс!еаг Согр.) составляет всего лишь около 70000. Самые мелкие молекулы этого препарата могут проходить через клеточные стенки некоторых бактерий, хотя и не всех. Поэтому в одних случаях этот препарат пригоден, а в других нет, и, прежде чем использовать его в опытах с определенными клетками, нужно определить порог пх проницаемости. Конечно, можно метить более крупные молекулы декстрана '"С-цианидом с помощью обычных методов получения карбоксил-декстрана.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
