Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 80
Текст из файла (страница 80)
18.2.4). Этот фермент синтезируется только в анаэробных условиях и требует в качестве индуктора ХО, (удаление ХОз приводит к деиндукции). 18.4.3. Репрессия конечным продуктом реакции (ориитин — карбамоилтрансфераза) Этот важный регуляторный процесс легко демонстрируется на большинстве штаммов Е, со(1 при сравнении культур, выращенных на основной среде, содержащей глюкозу и минеральные соли, в присутствии (.-аргинина и без него 1311. Орнитин — карбамоилтрансфераза катализирует шестую, заключительную, стадию синтеза конечногопродукта — (.-аргинина. В присутствии (.-аргинииа синтез фермента репрессируется.
Это можно показать при выращивании дикого штамма в течение ночи в любой подходящей солевой среде (например, как описано в других разделах этой главы), содержащей для культуры 1: 0,02 М раствор глюкозы; для культуры 2: 0,02 М раствор глюкозы и 1.-аргннин (100 мкг/мл); для культуры 3: 0,02 М раствор глюкозы н другую аминокислоту, например гистидин (100 мкг/мл).
Клетки собирают, промывают 0,1 М трис НС1-буфером, рН 7,8, и определяют орннтин — карбамонлтрансферазу, как описано выше. 4!6 18. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ 18.4.4. Мультивалентиая репрессия (1.-треониндегндратаза) С помощью подобной же серии опытов можно продемонстрировать чувствительность (.-треониндегидратазы (синтезирующего фермента) к мультивалентной репрессии конечным продуктом реакции ((.-изолейцином, 1-лейцнном, (,-валином). Для такой репрессии требуе~- ся присутствие всех трех аминокислот (Умбэргер, личное сообщение) . Культура 1:200 мл минимальной среды н 0,02 М глюкоза. Культура 2: 200 мл минимальной среды, 0,02 М глюкоза, 0,8 мМ 1.-валин, 0,4 мМ 1-лейцин и 0,4 мМ 1.-нзолейцип.
Культура 3: 200 мл минимальной среды, 0,02 М глюкоза, 0,8 ММ 1.-валин, 0,4 мМ 1.-лейцнн и 0,15 мМ 1.-изолсйцин. С помощью описанного выше теста на треониндегндратазу измеряют удельную активность фермента в клетках, выращенных в течение ночи в трех описанных выше средах. В культуре 2 должна выявляться более низкая ферментатнвная активность, чем в культуре 1. Культура 3 будет подвергаться дерепрессии относительно культуры 2 из-за постепенного снижения внутриклеточной концентрации (.-нзолейцнна (содержание 1-нзолейцина в культуре 3 понижено с самого начала, и, кроме того, его поглощение ингибируется двумя другими аминокислотами) .
Опубликован прекрасный полный обзор общих методов, применяющихся для определения активности ферментов и путей регуляции их биосинтеза 151. 18.4.5. Индукция плюс репрессия (1ас-оперон) Прн функционировании 1ас-оперона Е. со(1 происходит как репрессивная (отрицательная), так и индуктивная (положительная) генетическая регуляция (рис. 18.6), Присоединение 1ас-репрессора (продукта гена 1) к сайту оператора предотвращает трапскрнпцию генов, катализируемую РНК-полимеразой (отрицательная регуляция). Ипдуцирующий агент (любой из ~-галактозндов) 417 ЧАСТЬ !Щ МВТАВОЛИЗМ Рлеулллирнзт делак мзс-апарина ,д-Галактазидные мртектпрм снапример.
1РТС1 Р О й А сгза-аперан В Гплактазидаза (сЯМР— СРР) )З -Галантна пермеаза сААЗР РР, .Ю-Гплактазид- трансацетипаю яалнилатциклаза АТ Рнс. 18.6. Положительная и отрицательная регуляция (ас-опероиа у Е, сац Компоненты, участвующие в транскрипции 1ас-оперона, включают: гены 2, У и А, иодирующие ()-галактозидазу, р-галантозидпермеазу и ()-галантозидтрансацетплазу соответственно; регуляторный ген 1, кодирующий образование регуляторного белка 1ас-оперона; промотор (Р) и онератор (О); а также гены суа и сгр, иодирующие синтез аденилатцнклазы, и белок, связывающий сАМР (СкР), сост. ветственно.
1РТП вЂ” изопропил-р-(з-тногалактопиранозид. модифицирует белок-репрессор таким образом, что он теряет способность связываться с оператором. Однако одного этого недостаточно для инициации процесса транскрипции. Чтобы РНК-полимераза смогла осуществлять свою каталитическую функцию в транскрипции, необходимо присутствие положительного регуляторного элемента — белка — рецептора сАМР (продукта сгр-локуса). Такой модифицированный благодаря связыванию сЛМР белок присоединяется к промотору. В результате включается (ас-оперон и начинается транскрипция.
В отсутствие индуктора (деиндукция) или при уменьшении образования сАМР пз-за ингибирования аденилатциклазпой активности (катаболнтпая репрессия) транскрипция предотвращается. Адепилатциклаза — это связан- 418 13. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ный с мембраной фермент, катализирующий превращение АТР в сАМР и пирофосфат. Этот фермент обычно активен во время роста культуры в различных средах, и поэтому клетки образуют сАМР в достаточном количестве.
Однако в присутствии некоторых субстратов, например глюкозы или маннита, активность фермента ингибируется и образование сАМР снижается (это явление называют катаболнтной репрессией). Основные черты этих регуляторных явлений можно продемонстрировать в серии опытов, в которых следя~ за синтезом р-галактозидазы, как описано выше (с использованием клеток, обработанных толуолом), при регуляции экспрессии 1ас-оперона. Обычно используют штаммы Е.
сой К-12, Е. соД М130 или другие дикие штаммы. Клетки быстро растут в солевой среде, содержащей 0,25 — 0,50' безвитаминного гидролизата казенна (гидролизованного кислотой) в качестве единственного источника углерода и энергии (равд. 18.4.2). В этих условиях синтез 8-галактозидазы при добавлении 1 мМ изопропил+О-тногалактопиранозида в качестве дополнительного индуктора почти не репрессируется.
Азробную культуру выращивают в течение ночи (15— !7 ч при 37'С) в указанных выше условиях, клетки собирают центрифугнрованием, суспендируют в стерильном 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 7,5 (или физиологическом растворе), и инокулируют ими среды, состав которых дан в табл. 18.2 (в !25-мл колбы). В 0 мин и затем с 20 — 30 мин интервалами отбирают пробы по 1,0, 0,50 или 0,20 мл и добавляют их соответственно в 4,0, 4,5 или 4,8 мл 0,05 М натрий-фосфатиого буфера, рН 7,5, для получения разведений культуры 1: 5, 1: 10 или 1: 25.
Начинают с разведения 1: 5 и затем переходят к большим разведениям, когда в предыдущем оптическая плотность при 420 нм достигает значения 0,50. Для каждого разведения записывают значения А444 и используют их для подсчета сухого веса клеток на основе калибровочной кривой, отражающей зависимость между А444 и сухим весом клеток. Эти же разведения обрабатывают одной каплей толуола и одной каплей 0,1з -ного дезоксихолата натрия и ипкубируют со встряхиванием при 37'С в течение !5 мин. После инкубации до отбора аликвот (по 0,20 мл) для последую- 4!9 часть пд матдволизм таблица 18.2. Приготовление культур для обнаружения регуляции 1ас-оперона Е сап с помощью сАМР Объем, добавляемый в колбу, мл 5 ~ б 16 !6 !6 16 !б 16 0,5 0,5 Основная среда (1,25Хнониая сила) Гидролизат казеина (1Ое(эный) Дистиллированная вода Глюкоза (1 М) сАМР (20 мМ)э 1РТО (20 мМ) Инокулят', около 1 мг1мл клеток (сухой вес) 0,5 0,5 0,5 0,5 2,5 3,5 2,! 0,4 1,0 1,0 2,1 О 4а 1,0 1,0 1,6 0,4 0,5' 1,0 1,0 1,б 0,4 0,5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 а К этой пультуре глюкозу добавляют приблизительно через !50 мнп после добавлении !Рте 1изопроппт.б-о-тнагалактопиранознда1.
б сДМР солюбилиэируют нейтрализацией Хаон. е Э; этой культуре сЛМР добавляют приблизительно через !50 мин после внесения !Рте. Клетки добавляют к смеси основной среды, воды и гидролнзата казвина и подраюивают их около 00 мин. В конце инкубации добавляют 1ртс и другие соединения. как указано Этот люмент принимают за точку отсчета времени эксперимента. 420 щего анализа на р-галактозидазу (разд.
18.2.8) пробы помещают в ледяную баню. Строят график роста каждой культуры (на полулогарифмической бумаге), по оси ординат откладывая количество клеток (сухой вес) в мкг(мл, а по осн абсцисс — время. Еще один график строят на миллиметровой бумаге, откладывая по оси ординат суммарное количество фермента в 1 мл культуры, а по оси абсцисс — количество клеток, сухой вес в микрограммах на 1 мл культуры. Наклон этого графика Р соответствует скорости синтеза фермента.
После расчета удельной активности при каждом определении [в единицах активности на 1 мкг клеток (сухой вес)] строят график зависимости этой величины от времени. Г!ри сравнении культур 1 и 2 выявляется необходимость индуктора для синтеза р-галактозидазы, при сопоставлении культуры 3 с культурой 2 четко видна репрессия глюкозой, а при сопоставлении культуры 4 1а.
ФврмантлтивнАЯ АктиВность Рис. 18.7. Регуляция 1ас.оперона Е. сои пиклическим АМР. Все культуры индуцироаали 1РТС (изопропил-р-Р-тиогалактопнранозндом), за исключением культуры А Среда с культурой 2 в качестве единственного источника углерода и энергии содержит гидро.
лнзат казеина. Среда с культурой Д 3 имеет тот же состав, что и среда с культурой 2, но в нее добавлена еше глюиоза. Среда с культурой 4 имеет тот же состав, что и среда с культурой 3, но в нее добавлен еше сАМР. Среда с культурой 5 имеет тот же состав, что и среда Пузгю агу с культурой д, на через 1 — 2 ч после начала индукции в нее внесена глюкоза. Среда с культурой б имеет тот же состав, что и среда с культурой 4, но через 1 — 2 ч после начала индукции в нее внесен сАМР.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
