Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 76
Текст из файла (страница 76)
С некоторыми из этих способов можно познакомиться на примере восьми описанных ниже методик, в которых определяют активность ферментов каждого из шести классов: оксндоредуктаз, трансфераз, гидролаз, лиаз, изомераз и лигаз. Ферменты каждого класса участвуют в регуляторных процессах метаболизма. Методы изучения регуляции ферментативной активности и синтеза ферментов рассматриваются ниже в этой же главе. Все ферменты, активность которых определяют в приведенных здесь методиках, встречаются в клетках широко распространенных диких штаммов Е.
со!1, например в клетках штамма Крукса (АТСС 8739), штамма 1Ч (АТСС 9637) или штамма К-12 (АТСС 14948). 18.2.4. Оксидоредуктазы (иитратредуктаза) Нитратредуктаза (цитохром) (КФ 1.9.6.1, ферроцитохром: нитрат оксидоредуктаза) катализирует следующую окислнтельно-восстановительную реакцию: Ферроцитохром + Нитрат — ~- Феррицитохрои + Нитрит. Такая ннтратредуктаза является связанным с мембраной ферментом дыхательной цепи, ассоцнированным с формиатдегидрогеназой и цитохромом Ь. Индукции его синтеза происходит в условиях анаэробного роста, при которых ХОа- может служить акцептором электронов при анаэробном дыхании. Ферментативную активность разрушенных клеток определяют при наличии соответсзврющего восстановителя (например, метилвиологена).
Ниже приведена методика, разработанная Лоу и Эвансом !27), краткое описание которой содержится в Мог()нпд1оп Епгугпе Манна! (9). 395 ЧАСТЬ !Ч. МЕТАБОЛИЗМ Для приготовления контрольной пробы берут равные объемы (О,1 мл) 0,15 М фосфата калия, рН 7,0, 0,02о(хного метилвиологена и свежеприготовленного на дистиллированной воде (перегнанной с помощью стеклянного дистиллятора) раствора, содержащего 23 мМ дитионит натрия и 48 мМ бикарбонат натрия. При температуре 30'С к контрольной пробе и опытной пробе (содержащей вместо воды 0,1 мл 0,10 М нитрата натрия) добавляют фермент.
Реакцию останавливают усиленной аэрацией (до полного исчезновения синей окраски). Количество образовавшегося нитрита определяют колориметрически следующим образом. К 0,4 мл анализируемой смеси быстро добавляют 0,5 мл 58 ММ сульфаниламнда (приготовленного в 3 н. НС1) н 0,5 мл 0,39 ММ )н-(1- нафтил) этилендиамингидрохлорида. Добавляют 1,5 мл воды и ннкубируют прн комнатной температуре 10 мин. Измеряют оптическую плотность при 540 нм, используя в качестве слепой контрольную пробу. Количество микромолей образовавшегося ХОх находят по ранее построенной калибровочной кривой. 18.2.5. Оксидоредуктазы (сукцинатдегидрогеиаза) Сукцннатдегидрогеназа [КФ 1,3.99.1, сукцинат: (акцептор) оксидоредуктаза) катализирует окисление сукпината через ряд акцепторов электронов с помощью следующей окислительно-восстановительной реакции: Сукцинат+Акцептор — Фумаргт+ Восстановленный акцептор.
Сукцинатдегидрогеназа — это связанный с мембраной флавопротеиновый компонент цикла трнкарбоновых кислот, Он функционирует только в аэробных условиях, а его синтез частично находится под контролем сЛМР, по крайней мере у Е. сой. Активность фермента в разрушенных клетках или очищенных мембранных препаратах определяют с помощью непрерывного спектрофотометрического анализа (1), включающего восстановление цитохрома гл Сукцинат+ Фенааинметосульфат (ФМС) — е Фумарат+ ФМСН; ФМСН + Цитохром с (окисленный) — н ФМС+ Цитохром с (восстановленный).
нс овгментлтиандя активность Скорость восстановления цитохрома измеряют с помощью однолучевого спектрофотометра при 550 нм. Кривая оптической плотности регистрируется на ленточном самописце. Реакционная смесь состоит из 50 мл 0,1 М калийфосфатного буфера, рН 7,6, 2,5 мл 1М сукцината. 10 мл 0,01 М ЭДТА, рН 7,6, 0,75 мл КСХ (5,8 мг/мл) и 42,5 мл дистиллированной воды. 2,5 мл этой смеси вносят в пробирку, содержащую от 5 до 100 мкл фермента, и инкубируют 15 мин при 23'С. 1,95 мл этого раствора переносят в кювету, добавляют 15 мкл цитохрома с (тип1Н 5)пгпа, из сердца лошади, 250 мг)2,4 мл) н перемешивают.
Спектрофотометр устанавливают на нуль, регулируя ширину щели. Реакцию начинают добавлением 25 мкл феназинметосульфата (ФМС; водный свежеприготовленный раствор с концентрацией 12 мг/мл, который хранят в темной склянке). Эксперимент проводят в затемненной комнате. Скорость реакции находят по наклону кривой оптической плотности, записываемой самописцем (измеиение оптической плотности 1ЛА1 в 1 мин). Единицу активности сукцинатдегидрогеназы выражают в микромолях цитохрома с, восстанавливаемого в 1 мин (ЛА —:коэффициент экстинкции аеас=29,9) в этих условиях.
Вместо цитохрома с в подобном эксперименте можно использовать 2,6-дихлорфенолиндофенол, 18.2.6. Трансферазы (фосфофруктокиназа) Фосфофруктокиназу (КФ 2.7.1.11, АТР: Т)-фруктозо- 6-фосфат 1-фосфотрансферазу) можно определять по" следующей методике, разработанной для дрожжевой фосфофруктокиназы [431. Непрерывно спектрофотометрируют реакционную смесь, в которой протекают следующие трансферазные реакции: Фруктоао-6-фосфат (Ф-6-Ф) + ОТР— а Фруктозо-!,б-дкфосфат (Ф.Д-Ф) + 0))Р Лльдоааза Ф-Д-Ф вЂ” -~ Глкцеральдегид-З.фосфат (Г-3-Ф) + Дкгкдрокскацетонфосфат (ДАФ) Г-3-Ф вЂ” ч ДАФ 2ДАФ+ 2)ЧАОН вЂ” — а 2 Глицерол-ЗФ+ 2ХА)) Ф-б-Ф+ ОТР+ 2ХАОН вЂ” ~.
Я)Р+ 2 Глицерол.З-Ф+ 2ХАР. 397 ЧАСТЬ ПА МЕТАБОЛИЗМ <АСТР используют вместо АТР, вызывающего аллостерическое ингибирование. В состав реакционной смеси входят (указаны конечные концентрации): ! мМ Ф-б-Ф, 1 ММ ОТР, 5 мМ МпС!м 25 ММ фосфат калия, рН 6,5„ 5 мМ этантиол, 0,15 ММ ХА1)Н, 0,1 ед./мл альдолазы, 1 ед. (в 2 мл) глицеролфосфатдегидрогеназы, 1,5 ед./мл триозофосфатизомеразы. За окислением внесенного ХАЕН наблюдают в кювете (с длиной оптического пути 1 см), содержащей 2,0 мл смеси. Реакцию начинают добавлением фосфофруктокиназы (не более 1О-' ед.
фермента) и наблюдают за ней по снижению оптической плотности при 340 нм. В каждом эксперименте, особенно с неочищенными препаратами, готовят контрольную пробу без ОТР для определения активности 1(АРН-оксидазы. Значение оптической плотности в контрольной пробе вычитают из соответствующего значения опытной пробы.
При количественном анализе аллостерической регуляции с помощью АТР, АРР и АМР в неочищенных экстрактах, содержащих глюкозофосфатнзомеразу„важно не допускать значительных изменений концентрации Ф-6-Ф в результате изомеризации. Для этого можно добавить 0,2 М нейтрализованный раствор глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф) н 20 ед. Г-6-Ф-изомеразы на 1 мл.
В течение 1 ч при комнатной температуре в растворе будут находиться 0,05 М Ф-6-Ф и 0,15 М Г-6-Ф. За международную единицу принято количество фермента, которое фосфорилнрует 1 мкмоль Ф-6-Ф в 1 мин в описанных выше условиях при 25'С (АА,4,— '.
2 —:6,22 10'= (микро- моли в 1 мл) 2=микромолн на кювету]. АТР является субстратом и аллостерическим ингибитором фосфофруктокнназы, и его действие зависит от концентрации Ф-6-Ф. АМР снимает ингибируюшее действие АТР. Цитрат также является ннгнбитором, особенно в присутствии АТР, а ХНМ напротив, активирует фермент. 18.2.7. Трансферазы (орнитин — карбамоилтрансфераза) Орнитин — карбамоилтрансфераза (КФ 2.1,3.3, карбамоилфосфат: 1.-орнитин карбамоилтрансфераза) катализирует шестую стадию синтеза (.-аргинина у Е. соД 18. ФВВМВНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ и репрессируется конечным продуктом этого синтеза.
Фермент осуществляет следующую трансферазную реакцию: Орнитин + Карбамоилфосфат — ч. Цитруллин + Неорганический фосфат. За реакцией следят по появлению производных форм продукта, как описано Нейхардтом и Бойдом [31). Как и в случае с р-галактозидазой, в качестве источника фермента используют клетки Е. со)1, обработанные толуолом, или неочищенные экстракты Е. Сой. К 2 мл обработанных толуолом клеток, разведенных в нужной концентрации, добавляют 0,3 мл 62 мМ карбамоилфосфата и 0,3 мл 50 мМ МпС18.
Реакцию запускают добавлением 0,3 мл 0,1 М ).-орнитииа. Инкубируют 20 мин при 37'С, затем останавливают реакцию охлаждением во льду и добавлением 2,0 мл 0,25 н. НС1. Смесь хорошо перемешнвают и центрифугируют для удаления клеток. Надосадочную фракцию слнвают в пробирки. Для определения образовавшегося цитруллина отбирают необходимое количество надосадочной фракции (от 0 до 2,0 мл) и обрабатывают следующим образом. Разводят пробы до 2,0 мл дистиллированной водой (контрольная проба содержит только воду) и добавляют специальной пипеткой 1,0 мл смеси серной и фосфорной кислот (1: 3) и 0,13 мл 3%-ного 2,3-бутадионмоноксима.
Хорошо перемешивают, закрывают пробирки стеклянными шариками и нагревают в бане с кипящей водой в течение 10 мин. Затем пробы охлаждают 10 мин в закрытой от света холодной водяной бане (свет вызывает побочную реакцию). Измеряют оптическую плотность при 490 им и находят количество молей образовавшегося цитруллина по калибровочной кривой, полученной для ).-цитруллина в диапазоне от 0 до 0,25 мкмолей.
За единицу активности фермента принимают такое его количество, при добавлении которого образуется 1 мкмоль цитруллина в 1 мин в указанных условиях. 399 ЧАСТЬ Щ. МЕТАБОЛИЗМ 18.2.8. Гидролазы (~-галактозидаза) 8-Галактозидаза (КФ 3.2.1.23, р-О-галактозид — галактогидролаза) катализирует следующую гидролазную реакцию: о-Нитрофанил+О-галактониранознд (ОНФГ) + Н О вЂ” ~ вша. Галактоза -1- о-Нитрофенол. Вместо лактозы — естественного субстрата для этого бактериального фермента — можно использовать искусственный субстрат о-нитрофеиил-8-О-галактопиранозид (ОНФГ), который не окрашен, но при гидролизе образует о-нитрофенол, имеющий в щелочном растворе желтый цвет. Реакция протекает в присутствии бесклеточного экстракта или клеток, обработанных толуолом; для стимуляции в смесь добавляют ионы !4аа или тиоловые реагенты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
