Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 74
Текст из файла (страница 74)
С его помощью можно разрушать клетки бактерий, обычно трудно поддающиеся разрушению (например, грамположительных коннов). В общем наиболее распространенные физические методы разрушения клеток можно классифицировать следующим образом в порядке уменьшения их дезинтегрирующего действия: пресс Хьюза)вибрационные мельницы) пресс Френча) ультразвук) растирание с окисью алюминия. По устойчивости к разрушению клетки различных микроорганизмов можно расположить в последовательности (в порядке уменьшения): дрожжи) >мицелий грибов>грамположительные кокки>грамположительные палочки) грамотрицательные палочки) галобактерин -микоплазмы. Способ разрушения клеток выбирают в основном эмпирически в зависимости от вида клеток, нужного объ- члсть ш.мвткволнзм ема экстракта, чувствительности фермента1ов) к инактивации или изменению в процессе разрушения и необходимости последующего хранения.
Часто это приходится делать методом проб и ошибок. 18.2. ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОСТИ 18.2.1. Общие замечания Метод определения активности фермента должен быть по возможности точным, чувствительным, непрерывным, удобным н специфическим для изучаемой реакции. Однако чаще всего выполняются далеко ие все эти требования. Поэтому, прежде чем признать метод пригодным для использования, необходимо провести многочисленные контрольные и стандартные тесты. Ниже приведено краткое описание этих тестов. Изменяющиеся условия эксперимента В большинстве случаев для определения активности ферментов каждого определенного вида организма нужны специальные условия. Нельзя применять один и тот же метод для изучения ферментов одного типа у различных видов бактерий. От вида к виду могут сильно различаться потребности бактерий в ионах и кофакторах, оптимумы рН и температуры, значения Км, чувствительности к ингибиторам и равновесия реакций.
Классический пример такого типа вариаций — бактериальная сукцинатдегидрогеназа: условия определения активности этого фермента настолько варьируют, что авторы часто не указывают состав реакционной смеси [351. Подавление активности Если в неочищенном экстракте ферментативная активность не обнаруживается, это еще не означает, что организм, из которого приготовлен экстракт, не содержит этот фермент. Частичная или полная потеря активности фермента, присущей данному микроорганизму, может произойти во время приготовления экстракта. Внутри клетки фермент защищен от инактивации окси- 386 ПЬ ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ дантами и другими веществами окружающей средой и многочисленными белок-белковыми взаимодействиями, которые нарушаются в результате разрушения клеток.
В связи с этим следует отметить, что содержание белка в большинстве клеток превышает 100 мг/мл 1281. Однако чаще всего в анализах 1п ч11го используют разбавленные водные растворы ферментов, так как в этих условиях легче осуществлять контроль в процессе зкс. перимента. Особенно важно учитывать влияние концентрации белка на активность фермента при изучении регуляторных ферментов [281. Если предполагают, что причиной инактивации фермента является его чувствительность к кислороду, перед разрушением клеток в среду добавляют антиоксиданты, такие, как восстановленный глутатион, 8.меркаптоэтанол или дитиотрейтол.
Можно также проводить разрушение клеток и все последующие процедуры в аназроб. ной камере. Анаэробная камера дорого стоит, и работа в пей связана с определенными неудобствами, однако в некоторых лабораториях для предотвращения инактивации ферментов успешно применяют именно этот способ. Чтобы уменьшить инактивацию, вызываемую двухвалентными ионами, часто в клеточные экстракты добавляют хелатобразующие агенты, например ЭДТА.
Поскольку многие ферменты 1п ч11го чувствительны к инактивации теплом, экстракты клеток обычно готовят и хранят при температуре 0 — 4'С. Однако некоторые ферменты инактивируются при низкой температуре и при 0 †4 'С быстро теряют активность. Если не удается обнаружить активность фермента, который, по-видимому, присутствует в неочищенном экстракте, это может объясняться рядом причин. Вопервых, предположение о присутствии фермента может быть ошибочным.
Во-вторых, фермент может присутствовать в экстракте, но не проявлять активность, пока в реакционную смесь не будут внесены недостающие компоненты или из нее не будут удалены ингибиторы его активности. Причины такого рода уже обсуждались выше, а некоторые друтие факторы рассматриваются в большинстве работ, указанных в списке литературы по этой теме. ЧАСТЬ !Ч. МЕТАБОЛИЗМ Помимо всего прочего, рекомендуется проводить контрольный эксперимент, добавляя к исследуемой смеси экстракт клеток, заведомо содержащий интересующий фермент ~501.
Если в условиях проводимого эксперимента контрольный фермент проявляет активность, можно с уверенностью (хотя и неполной) считать, что экстракт содержит все необходимые компоненты н не содержит ингибиторов, Но даже после проведения такого контроля и выявления активности добавленного фермента полной уверенности в отсутствии исходной активности нет. Ее отсутствие может быть обусловлено множеством непредсказуемых факторов. Например, не исключено, что фермент присутствует в экстракте в неактивной форме. Йзвестно также о существовании реакций, в результате которых фермент становится неактивным нз-за ковалентных изменений в его белковой части (разд.
18.3.4). Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ Определению ферментативной активности могут мешать конкурентные побочные реакции. Концентрации субстратов илн образующихся веществ могут настолько сильно меняться в результате таких конкурентных реакций, что точное измерение активности становится невозможным. Например, активность ХА11Н-оксндазы или аденозинтрифосфатазы в неочищенных экстрактах может быть такой высокой, что определение образования или потребления )ч)АВН или АТР соответственно будет вызывать большие трудности. Необходимо либо учитывать побочные реакции путем соответствующего контроля, либо находить способы их подавления нли нарушения. Вместе с тем конкурентные реакции используются при разработке методик сопряженного анализа.
Такие методики предусматривают взаимодействие исходного фермента (активность которого измеряют) с одним нли двумя вспомогательными ферментами, внесенными в реакционную смесь: 1а. ФерментАтивндя АктиВность исходный фермент Вспомогательный фермент в с, Исходный фермент Вспомогательный фермента А— в с Вспомогательный ферменте — ь Применение сопряженного анализа, а также некоторые способы регулирования конкурентных побочных реакций можно проиллюстрировать на примере описанной Вудом 1501 методики общего определения киназ.
Она применима также ко многим другим субстратам, включая глюконовую и 2-кетоглюконовую кислоты, пентозы и полиолы, а также гексозы. Методика основана иа взаимодействии АРР, образованного в результате реакции, катализируемой АТР- кииазой (исходного фермента), с пируваткнназой и лактатдегидрогеназой (два вспомогательных фермента): Кннааа гхОН+ АТР— е аьОР + АОР; Пнрунатнннааа Аогтс ф гу * Аггеем Лантатдегндрогенааа Пкруват -(- АРАОН -ь. Лактат+ ИАО. Как было установлено, скорость реакции, катализируемой исходным ферментом, является фактором, ограничивающим скорость общей реакции; ее определяют путем непрерывного измерения изменяющейся со временем оптической плотности при 340 нм и выражают в микромолях в 1 мин, зная коэффициент экстинкции (6,22+10' смЧмоль) и объем реакционной смеси.
Затем вычисляют удельную активность в микромолях субстрата, фосфорилируемого в 1 мин, на 1 мг белка. Применение повторного синтеза АТР в этой системе дает явное преимущество, заключающееся в возможности использования малых количеств АТР, что позволяет снизить участие АТР в побочных реакциях и одновременно уменьшить возможное ингибирование киназы аденозинтрифосфатом. Концентрация АТР остается почти чАсть пп метАБОлизм постоянной.
Применяя регистрируюп1ий спектрофотометр, получают более надежные данные, чем в СЛУчае однократного определения активности в каждой точке. Для анализа готовят следующие реактивы: 0,7 М трис НС1, рН 7,5; 0,1 М МпС!~1 0,05 М Хаэ-АТР; 0,05 М тринатрий- или трицнклогексиламмонийфосфоенолпируват; 0,15 М глутатион натрия (восстановленный); 0,005 М Иаз-МАРН; 0,15 М лактатдегидрогеназа; 0,15 М пируваткиназа и О,!5 М субстрат, В микрокювету (1,25р, Х1,25Х2,5 см, объем 0,5 мл; Ругосе11 Мапп1ас1пг(пд Со., %ез(1воод, Х, 3.) вносят с помощью микропипетки илн шприца для газового хроматографа 0,05 мл трис-буфера, по 0,01 мл МпС1ъ АТР, фосфоенолпирувата, глутатиона и г(АОН, 0,5 мкл лактатдегндрогеназы, а также воду, киназную фракцию и субстрат до конечного объема 0,15 мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
