Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 70
Текст из файла (страница 70)
Пластмассовые шприцы и соответствующие иглы. Шприц с гефлоновым поршнем, открывающийся для отбора пробы газа и закрывающийся для удержания в нем пробы. Высокоочищенный поставляемый фирмами ацетилен в инертном газе (1 — 4%, по объему). (Предупреждение! Баллон с газом должен быть фиксирован у стола. Редуктор должен соответствовать баллону.) и В отдельных случаях методика с восстановлением анетилена для определения нитрогсиазы испримснима, например в присутствии метана, который утилизируют искоторые бактерии.
— Прим. ред. 364 гл химический состАв Методика Чистые или накопительные культуры выращивают в колбах или пробирках со средой, не содержащей азота. Наилучшие результаты получают с аэробными культурами, которые имеют лишь слабую мутность. Объем газа над средой в колбе или пробирке должен превышать объем жидкости в 5 — 10 раз. До добавления ацетилена сосуды следует герметически закрывать. Ацетилен добавляют до конечного давления 0,05 — О,!О атм, что эквивалентно насыщению нитрогеназы при 0,8 атм 5)з 185).
Состав остальных компонентов газовой фазы зависит от типа исследуемых бактерий (аэробного илн анаэробного). Для стандартизации вводимого ацетилена и обнаружения иебнологического восстановления ацетилена аналогичные операции проводят со стерильными средами или со средами, содержащими клетки, убитые формальдегидом. Отбираемые из них пробы тестируют на ацетилен и этилен немедленно после инкубационного периода. Этилен определяют с помощью газового хроматографа после нескольких часов ннкубации при соответствующих освещении и температуре (для чистых культур обычно достаточно 3 ч) в отбираемых из газовой фазы пробах (50 мкл).
Времена удерживания для ацетилена и этилена устанавливают либо согласно инструкции фирмы-изготовителя или поставщика материала насадки, либо с помощью стандартов ацетилена и этилена. Количество образующегося этилена определяют по высоте пика (учитывая настройку диапазона и регулятора чувствительности хроматографа) в сравнении со стандартом. Оно должно быть равно количеству восстановленного ацетилена, если установлено, что образующийся этилен не является естественным побочным продуктом метаболизма исследуемых микроорганизмов.
Для определения количества молей фиксированного 5(з следует разделить число молей восстановленного СзНз на 3— результат будет соответствовать потребности в электронах для образования из 5(з аммиака. члсть !г мвтлволнзм Лрименение методики Эту методику применяют для чистых или накопительных культур азотфиксирующих микроорганизмов. Описана также модификация этой методики для ферментных препаратов !96).
17.6.11. Специфические азотсодержащие соединения Специфический качественный и количественный анализ азотсодержащих соединений, таких, как пептиды, нуклеиновые кислоты, пестициды и загрязняющие вещества, можно осуществлять с помощью масс-спектрометрни. Достоинствами этого метода являются его специфичность, возможность обнаружения малых количеств вещества и использования небольшого количества пробы (микрогрвммов или микролитров), а также возможность определения вещества в любом состоянии — газообразном, жидком и твердом. Основной его недостаток заключается в том, что для него необходимо специальное оборудование, а обработка полученных данных имеет свои трудности.
Теория и применение массспсктрометрип подробно описаны в ряде работ !"69, 72, 74). 17.7. ОРГАНИЧЕСКИЕ КИСЛОТЫ И СПИРТЫ Органические кислоты и спирты с короткими цепями образуются в бактериях в качестве промежуточных или конечных продуктов цикла лимонной кислоты, гликолиза и других путей метаболизма. Эти соединения накапливаются в цитоплазме или выделяются в среду, В клетках бактерий они обнаруживаются в низкомолекулярной надосадочной фракции после осаждения макромолекул охлажденной ТХУ (рис. 17.1 в равд. !7.1).
Эта фракция включает ацетат, ацетоацетат, !1-оксибутиоат, цитрат-нзоцитрат, а-кетоглутапат, формиат, лактат. сукцинат, пируват, малат, фумарат, этанол и многие другие вещсства. !7. ХИМНЧЕСКИИ СОСТАВ Низкомолекулярные вегцества анализируют с помощью ионообменной (равд. 16.3.1), абсорбционной (равд. !8.5.2) или — что лучше всего — газожидкостной распределительной хроматографии (равд. !6.3,4). Лактат можно также анализировать ферментативным или колориметрическим методом (равд.
17.2.8). 17.8. ЭЛЕМЕНТЫ Содержаняе различных элементов в бактериальных клетках и биологическая роль микроэлементов обсуждаются в работах [107, !091; приготовление и хранение проб для анализа различных элементов описано в работах [107, 1!1). Содержание металлов в пробах, представляющих интерес для бактериологов, определяют с помощью колорнметричсских методов, метода атомной абсорбции, фотометрии, спектрофотометрии, пламенно- эмиссионной фотометрии, ядерно-активационного анализа, ионселективных электродов, а также другими способами. Этн и другие методы определения металлов описаны в работах [106 — 109).
1-1екоторые элементы, например кальций, определяют с помощью быстрой и удобной методики, которая основана на титрометрии и не требует специального оборудования. Элементы, мешающие определению, а также соединения, присутствующие в малых количествах, иногда удаляют соответствующей обработкой пробы. Такие методики описаны в работах [109, 1101. Метод пламенно-эмиссионной фотометрии [107, 108! идеально подходит для анализа щелочных и шелочноземельных металлов. С помощью атомно-абсорбционной спектроскопии можно обнаруживать миллионные доли приблизительно 40 элементов в различных образцах [107).
Принципы этих методов обсуждаются в работах [107, 108), Некоторые металлы анализируют точным и относительно удобным методом атомной абсорбции [106, 108). Для этого метода требуется специальный спектрофотометр, на котором может работать лишь опытный персонал. Присутствие в образце нескольких элементов и соединений мешает атомно-абсорбционному анализу исследуемого элемента, но при правильной обработке образца влияние помех уменьшается или может быть совсем устранено, 367 члсть ъч меткволизм Ядерно-активационный анализ 1108] основан на облучении образца с целью получения одного или нескольких радиоактивных элементов. Радиоактивные образцы идентифицируют и измеряют их количество.
Преимуществами этого вида элементного анализа являются высокая чувствительность и возможность определения многих элементов в одном небольшом образце. Для применения этого метода необходимы источник нейтронов с высокой энергией (ядерный реактор пли ускоритель), сложное оборудование для обнаружения изотопов, соответствующий компьютер и опытный персонал.
При наличии необходимого оборудования применение этого метода требует относительно меныпих затрат времени и средств, чем другие, если одновременно определяют несколько элементов в одном образце. Это особенно важно в случае, когда количество анализируемого материала ограниченно. Рентгеновская эмиссионная спектроскопия [108) является методом анализа, позволяющим количественно определять и идентифицировать некоторые элементы, присутствующие в биологическом материале в большом количестве, причем исследуемый материал при этом пе разрушается. Рентгеновский мнкроанализ с применением электронно-лучевого зонда используют для определения количества и местоположения некоторых элементов 1п з11н. Разрешение анализа позволяет применять его по отношению к отдельным бактериальным клеткам и спорам 1112). Этот метод также требует сложного оборудования и специальной подготовки персонала, поэтому он доступен обычно лишь научно-исследовательским лабораториям.
Описаны методы колориметрического и нефелометрического определения металлов и неорганических соединений, включая автоматизированный анализ 1'109); они опубликованы также в материалах Управления США по защите окружающей среды 1110'1. Имеющиеся в продаже ион-селективные электроды также представляют собой очень удобное и недорогое средство определения многих элементов, правда, нх применение ограничено несколькими типами образцов и элементов (разд. 16.2.2). !т. химическнн сОстАВ 17,9. ЛИТЕРАТУРА Фракционирование и радиоактивность 1. КеллеП О. Мс1Ьодв Епвупю!., 12А, 686 — 692 (1967). 2. У!оуеггя П. В., Савве О В., Вопол Е. Т., АЬе!яол Р.
Н.. Вп1- !ел П. У. В1овупйеыв 1и ЕясаеНсЬ!а сорб Сагпед!е !пв!. ТьгавЫпд1оп РиЫ., 607, ! 955. 3. Бийег!алд У. (р., )РПЬ!ггяол У. Р. 1п: У. л. Хогг!ь апд Е!ЬЬопв О. %, (ед.), Менюдв (и ия!сгоЫо!оку, чо1. 5В, р, 346 — 383, Асадепис Ргевв, 1пс., Ыеяч Уог1, 1971. Углеводы Общая литература 4 Со!описи У., Кар1ал У.
(ей), Ме(Ьодь Епяуто!., 8, 1 — 759 (1966). 5. Негбег! О., Рырря Р. У., Б!галке П. Е. !и: й. Хогг)ь апд О, ВУ. )7!ЬЬопь (ед.), Мейодь 1и т!сгоЫо1оиу, чо1. 5В, р. 209— 344, Асадст!с Ргевя, 1пс., Хеп Уогй 197!. б. %'ог(г Е. 1и: У. й. Ь(огг!ь апд О, %. (11ЬЬопь (сд.), Мс1Ьодь (и пдсгоЫо!оду, чо!.
5А, р. 361 — 418, Асадеппс Ргеья, 1пс., нем Уог1г, 1971. Сиециалвиал литература 7. ЕдьсЬе 2. У. Вю!. СЬет., 204, 983 †9 (1953). 8. Едьгуе 2.Ме1Ьодв СагЬобудг. СЬет., 1, 477 †5 (1962). 9. Е!яол Е. А., Могуал 97. Т В)осЬегп. У., 27, 1824 — 1828 (1933). !О. Роя О Е., Маугит Е. У., Ва!сЬ ат. Е., РуоЦе П, Я., атоеяе С. П. Ргос. Ыа!1. Асад. 3с(. Г$.А., 74, 4537 (! 977).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
