Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 69
Текст из файла (страница 69)
Кроме того, при таком анализе интенсивность окраски на единицу веса белка у различных белков варьирует меньше. В описываемой ниже модификации биурстовой реакции 183) используется тартрат, образующий с медью комплексы, которые растворимы в )4(аОН. Белок вытесняет нон меди из комплекса, в результате чего изменяются цвет и интенсивность поглощения.
Реактивы 1,5 г сульфата двухвалентной меди (СИ804 5НТО) и 6 г калий-натрийтартрата 4НЕО растворяют в 500 мл воды. Добавляют с перемешиванием 300 мл 1047р-ного (вес/объем) )4(аОН. Объем смеси доводят до 1 л дистиллированной водой. При появлении в реактиве осадка красноватого или черного цвета его выбрасывают. Методика 4 мл биуретового реактива, приготовленного, как описано выше, добавляют к нейтрализованной пробе (1 мл), содержащей 1 — 1О мг белка. Тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Время и температура должны быть строго одинаковыми для всех проб, в том числе для стандартных и конгрольных. Оптическую плотность измеряют при 500 нм. Контрольную пробу готовят, смешивая 1,0 мл воды или водного раствора, применявшегося для растворения белков, и 4,0 мл биуретового реактива.
Стандартную кривую строят, используя любой хорошо растворимый белок, например кристаллический бычий сыворо- 359 ЧАсть пл мвтхволпзм точный альбумип. Кривая имеет нелинейный характер из-за конкуренции между тартратом и белком за ионы меди. Применение методики Описанный Стикландом [102] модифицированный вариант этой методики применим для определения суммарного белка в бактериальных клетках. В этом случае в 1,0 н.
ХаОН растворяют клеточный белок, а затем СнЬОл, не добавляя тартрата. Нерастворимый клеточный материал и Сн(ОН)2 удаляют центрнфугированием, при этом окрашенный комплекс Сп — белок остается в растворе. 17.6.7. Определение белка по реакции с кумаси сипим Белки могут связываться с некоторыми красителями, в результате чего происходит сдвиг полос поглощения последних.
В описываемой ниже методике в качестве красителя используют кумаси яркий синий. Этот краситель существует в двух видах: его красная анионная форма переходит в синюю, когда краситель присоединяется к аминогруппам белков. Протекающие при этом реакции в большинстве случаев более чувствительны и менее подвержены вредному воздействию многих соединений, ограничивающих применение других способов определения белка 178]. Эксперимент с применением красителя занимает гораздо меньше времени, чем процедуры в описанных выше методиках. Чувствительность реакции с красителем сравнима с чувствительностью метода Лаури.
Она меньше зависит от вида белка по сравнению с цветными реакциями в описанных выше методиках, Реактив 100 мг кумаси яркого синего 6250 растворяют в 50 мл 95%-ного этанола. Добавляют 100 мл 85%-ной (вес/объем) фосфорной кислоты. (Предостережение) Сильная кислота! Ее нельзя насасывать в пипетку ртом. Необхо- 1х химичяския сОстАВ димо работать в защитных перчатках, очках и лабораторной одежде.) Объем доводят до 1 л дистиллированной водой. Методика К раствору, содержащему от 10 до 100 мкг белка в 0,1 мл, добавляют 5 мл красителя и тшательно перемешивают.
Оптическую плотность при 595 пм измеряют не раныпе чем через 2 мин и не позже чем через 1 ч. Для сравнения используют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл буферного раствора и 5 мл красителя. Содержание белка в пробе определяют по калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью стандартных растворов (содержащих от 5 до 100 мкг белка в 1 мл того жс буфера, который использовался для растворения опытных проб) и концентрацией белка в каждом стандартном растворе (разд. 1б.!.!). Применение методики Методика пригодна для определения многих растворимых белков. Детергенты мешают проявлению окраски, поэтому стеклянную посуду необходимо хорошо споласкивать водой. Линейность сохраняется лишь в интервале от 25 до 75 мкг белка в пробе.
Другие недостатки этого метода описаны Пирсом и Султером 195). Имеются описания микро- и других вариантов этой методики, отличающихся высокой воспронзводимостью и позволяющих обнаруживать 1,0 мкг белка [1О1]. 17.6.8. Определение белка спектрофотометрнческим методом Максимум поглощения белков наблюдается при 280 им; ои обусловлен присутствием в белках ароматических аминокислот — тирозипа и триптофана. Этн две аминокислоты входят в состав почти всех белков, и диапазон колебаний отношения их содержания к содержанию других аминокислот довольно узок.
Определение белков в растворе по оптической плотности раствора в ЧАСТЬ Ш. МЕТАБОЛИЗМ УФ-области целесообразно, если раствор белка содержит не более 20о (по весу) других соединений, поглощающих УФ-свет, таких, как нуклеииовые кислоты или феполы, и если он не мутный. Поправку на поглощение нуклеиновых кислот в растворе, содержащем белок, можно сделать по методу Варбурга и Кристиана [105) или методу Калкара [87). Оборудование Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения в УФ-области (равд, 16.1.1). Кварцевые кюветы, пропускающие УФ-свет.
Методика Оптическую плотность белков, растворенных в соответствующем буфере, измеряют при 280 и 260 нм. При каждой длине волны измерения проводят относительно контрольной пробы, содержащей буфер. Если отношение оптической плотности при 280 нм к оптической плотности при 260 нм не превышает 1,70, за исключением растворов, о которых известно, что они содержат чистый белок, то концентрацию белка определяют по приведенному ниже уравнению [87) или с помощью соответствующей таблицы [89). Уравнение используется для того, чтобы учесть вклад, который вносит оптическая плотность нуклеиновых кислот в оптическую плотность раствора: Концентрация белка (мг(мл)-1,45 А„,— 0,74 Амм Применение анетодака Если важно сохранить пробу малодоступного белка, эта методика незаменима. После измерения оптической плотности белок можно использовать в дальнейших исследованиях.
Различные белки могут иметь разные коэффициенты экстипкции, поэтому если важна точность измерений, то стандартные растворы следует готовить из одного и того же белка. 362 гх ХимичеСкий сОстАВ 17.6.9. Суммарный азот Общее содержание азота в пробс определяют, суммируя результаты анализов для отдельных азотсодержащих компонентов (НОз, НОз —, ХНА+ и органических со единений). Однако если исследователя интересует только суммарный азот, то проведение всех этих анализов, занимающее много времени, излишне. Чаще всего для определения суммарного азота применяют метод Кьельдаля, заключающийся в разложении органических азот- содержащих соединений с образованием ХНА" и последующем анализе этого иона по одной из известных методик.
Этот анализ включает определение НОА и ХО, — , восстановленных до ХНА~ подогретой щелочью [681 или салициловой кислотой и цинком [65). Другой способ, позволяющий использовать реактивы, приготовленные для анализа ХО,—, заключается в окислении ХНА+ до нитрита и последующем анализе интрига.
Способ расщепления органического вещества зависит от состояния пробы (твердого или жидкого). Поскольку методики расщепления по Кьельдалю разнообразны и сложны, а описания их приводятся в различных статьях, мы рекомендуем читателю обращаться к указанным ниже литературным источникам. Методы расщепления по Кьельдалю, разработанные для жидких проб, вклгочают анализ морской [73) и озерной [64, 68) воды, а также сточных вод [64, 68). Среди твердых проб могут быть образцы почвы [64 — 66, 711, осадочных пород [68), удобрений [70), веществ растительного [64, 70) и животного происхождения [70), а также микроорганизмов [68).
17.6.10. Молекулярный азот Необходимость обнаружения молекулярного азота в биологической системе обычно ограничивается работами по азотфиксации, в которых азот (двухатомный азот) восстанавливается с помощью ферментной системы (называемой нитрогеназой) до аммиака, ассимилируемого клетками. Количественный анализ этой реакции основан на исчезновении азота, который раньше определяли с помощью атомной абсорбции, илн на появ- 363 часть ш.
митлволизм ленин аммония и его измерении по описанному выше методу (разд. 17.6.3). Однако азотфиксацию легче измерять по способности нитрогеназы восстанавливать ацетилен (СяНз) до этилена (СзН,). Лцетилен и этилен определяют с помощью газовой хроматографии. Восстановление ацетилена обычно определяют в системах, обладающих достаточно высокой нитрогеназной активностью.
Это позволяет осуществлять кратковременное воздействие на ацетилен, что сводит к минимуму помехи, вызываемые небиологическим восстановлением ацетилена. При более длительном воздействии этн помехи можно уменьшить путем правильной постановки контроля.
Хотя никакая другая система быстрого восстановления ацетилена, кроме нитрогеназы, неизвестна, важно проверить ее наличие путем подавления реакции аммиаком 1961. Поскольку азотфнксация осуществляется как аэробными, так и анаэробными бактериями, схема эксперимента может быть различной [96), Большое значение имеют правильные условия инкубацнн, включая освещение и температуру. Определение активности нитрогеназы для систематики бактерий рассматривается в разд. 20.2.7, где продолжено обсуждение этого вопроса ". Оборудование и реактивы Газовый хрол~атограф с пламенно-ионизационным детектором и соответствующей колонкой для определения ацетилена и этилена.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
