Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 64
Текст из файла (страница 64)
При этом под полупрозрачным слоем клеточных стенок должен образоваться тонкий мутный слой неразрушенных клеток. Верхний слой отбирают, а осадок осторожно промывают охлажденным 0,1 М трис-буфером, рН 7, с помощью пастеровской пипетки. Когда объем верхнего слоя достигнет 15 мл, его вновь центрифугируют прн 1000 д в течение 1О мин.
Осадок отбрасывают, а надосадочную фракцию центрифугируют 15 мин прн 22000 и. Верхний слой ресуспендируют в трис-буфере. Эти операции повторяют до тех пор, пока нс получат гомогенную фракцию клеточных стенок, не содержащую интактных клеток. Фракцию клеточных стенок суспендируют в 100 мл насыщенного хлороформом трис-буфера. Добавляют дезоксирибонуклеазу (0,5 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл) и рибонуклеазу (1,0 мл раствора с концентрацией 5 мг/мл) и инкубируют суспензию при 37'С 30 мни. Добавляют 100 мкг кристаллического трипсина и продолжают инкубацию при той жс температуре еще 6 ч.
Клеточные стенки осаждают центрифугированпем н промывают, как описано выше. Осаждение и промывание повторяют до получения гомогенно. го слоя. Для удаления денатурированных белков добавляют трипсин. Этот фермент вызывает автолиз пептидогликана некоторых бактерий. В этом случае при центрифугировании осадка не образуется. Если это наблюдается, обработку трипсином проводить не следует. Выделение пептидогликана нз большинства грамотрицательных бактерий требует большого количества клеточного материала (20 — 30 г) из-за низкого содержания этого полимера в бактериях и его повышенной чувствительности к автолизу.
Методика получения 150 мг пептидогликана из клеток Е. соД описана Вейделем и др. 1551. Содержание гексозамина и мурамовой кислоты определяют после кислотного гндролиза очищенных клеточ- гк химичкскии состав ных стенок (разд. 17.2.7 и 17.2.8). Аминокислоты определяют с помощью аминокислотного анализатора или бумажной хроматографии [581. Наличие нескольких аминокислот означает загрязнение белками мембран, клеточной стенки или цитоплазмы. В работах Коттела и др, !511 и Гуйзена и др.
1481 продемонстрированы хорошие примеры того, как можно получить исчерпывающие данные о составе клеточных стенок с помощью различных химических методов, которые позволяют определять восстанавливающие сахара, незамещенные аминогруппы аминокислот и т. д. 17.4.2. Лнпополнсахарнды 1421 Реактивы, материалы и оборудование Фвзяологпческяй раствор: О,зэ(з.ный (вес/объем) раствор ХаС! в дистиллированной воде.
Раствор фенола: 10 мл дистиллированной воды добавляют к 90 мл подогретого (60 "С) дважды перегкаккого фенола. (Лредосгерелгеиие( Фепол вызывает сальные ожоги прп попадавпя на кожу я в глаза. Прк работе с этим реактпвом следует падевать защитные перчаткн, одежду к очкн. Пары фенола также опасны. С горящм феколом кеобходямо работать в вытяжном щкафу,) 1!енгркфугя, роторы н пробирка: центрнфуга ка 10 000 я в ульзрацектряфуга па 100 000 я; цептряфужные пробирки в роторы к пвм для обеях цектрпфуг.
Прибор для лкофвлпзацяк клп вакуумный эксккатор к вакуумкый ялк водоструйяый насос. Методика Бактериальные клетки примерно из 3 л ростовой среды центрнфугируют при 10000 д в течение 15 мин. Осадок суспендируют в 300 мл холодного физиологического раствора и снова центрифугируют. Повторяют процесс ресуспендировання н вновь центрифугируют с целью удаления компонентов среды. Отмытые бактерии лнофилизуют или хранят в морозильнике до использования. 20 г (сухого веса) бактериальных клеток тщательно суспендируют в 350 мл воды при 65 — 68'С. 350 мл раствора фенола нагревают до температуры 65 — 68'С и добавляют к клеточной суспензии.
Смесь энергично пере- ЧАСТЬ 1Ъ', МЕТАБОЛИЗМ мешивают, выдерживают 15 мин при 65'С, а затем охлаждают в ледяной бане до 10'С. Эмульсию центрифугируют 30 мин при 10000 д. При этом образуются три слоя: водный, фенольный и осадок. Иногда в фенольноводной интерфазе образуется слой денатурированного белка. Верхний водный слой удаляют и хранят отдельно. Удаляют и отбрасывают вещества на границе раздела фаз. К фенольному слою и осадку добавляют еще 350 мл воды н тщательно перемешивают, поддерживая температуру 65 — 68'С в течение 15 мин. Смесь вновь центрифугируют и верхний водный слой объединяют с водным слоем, полученным при первом центрифугировании. Водную суспензию диализуют 3 — 4 дня против дистиллированной воды для удаления фенола и низкомолекулярных примесей.
Днализованный раствор концентрируют под вакуумом при 37'С до 5 мл. Для этой цели удобно пользоваться роторным испарителем. Концентрированный раствор центрифугируют при 3000 я в течение 10 мин для удаления нерастворимых веществ. Осадок выбрасывают. Половину суспенднрованного органического вещества в надосадочной фракции составляет липополисахарид. Основной примесью является РНК. Надосадочную фракцию центрифугируют при 100000 я в течение 1 ч. Осадок тщательно ресуспенднруют в физиологическом растворе и снова центрифугируют 1 ч при 100 000 д. Центрифугирование и ресуспендирование осадка повторяют 5 раз для отмывания его от примесей.
Наконец, осадок растворяют в дистиллированной воде н лиофплизуют. Если нет возможности лиофилизовать осадок, суспензню можно высушить в вакуумном эксикаторе. Из 20 г (сухого веса) биомассы бактерий сем. Еп1егойас1еПасеае должно получаться 100 — 500 мг липополисахарида.
Этот липополисахарид представляет собой потенциальный эндотокснн [35, 39], содержащий прочно связанный липид А. 17.4.3. Выделение липнда А и полнсахарнда из липополисахаридной фракции Лцпид А можно выделить в виде водонерастворимого продукта после слабокислотного гидролиза очищенного липополнсахарида. Полнсахаридная часть полимера растворяется в воде. 1т. химический сОстАВ Реакгивок материалы и оборудование Уксусная кисло~а: 1сй-иый 1по объему) раствор готовят добав. левием 1 мл уксусной кислоты к 99 мл дистиллироваииой воды. (Осторожно! Нельзя иасасывать уксусную кислоту в пипетку ртом. Все операции выполияют в вытяжном шкафу, избегая контакта с жидкостью или парами.
При работе с коицеитрироваипой уксусной кислотой рекомендуется надевать защитные очки и одежду.) Лиофилизоваииый препарат липополпсахарида. Ампулы для лиофилизации иа 10 мл. Баллон со сжатым азотом. Вакуумный зксикатор или прибор для ляофилизации. Пеитрифуга иа 3000 К, 13-мл ггеитрифужпые пробирки, соответствующий ротор. Температурный контроль ие обязателен. Методика 0,1 г высушенного липополисахарида, полученного по описанной выше методике, суспендируют в 10 мл 1 7о-ной уксусной кислоты, через которую предварительно продували азот в течение 10 мин.
Ампулу с суспензией запаивают и нагревают в паровой бане 4 ч. Затем ампулу охлаждают и открывают, а ее содержимое переносят в пробирку и центрифугируют 10 мин при 5000 и. Надосадочную фракцию, содержащую полисахаридную часть липополисахарида, осторожно отделяют от нерастворимого липида А и сохраняют для дальнейшего анализа. Осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и снова центрифугируют. Ресуспендироваиие и центрифугирование повторяют 5 раз. Надосадочные фракции выбрасывают.
Осадок высушивают в вакуумном эксикаторе или лиофилизуют. Полисахарид, оставшийся в растворе после кислотного гидролиза, диализуют против 200 объемов воды и высушивают путем лнофилизации или в вакуумном эксикаторе. Из 100 — 500 мг липополисахарида можно получить 40 †1 мг безлипидного полисахарида и 30— 150 мг липида А. Количество липополисахарида или безлипидного полисахарида определяют с помощью тестов на 2-кето- 3-дезоксиоктанат и гептозу (равд.
17.2.9). Для определения количества липида А в очищенных препаратах применяют тест на гексозамины (равд. 17.2.6). 333 ЧАСТЬ ПА МВТАВОЛНЗМ 17.5. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ Наиболее широко распространенный метод определения и идентификации дезоксирибозы и рибозы нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в клеточных экстрактах включает экстракцию и гидролиз горячим раствором ТХУ илн хлорной кислоты и последующее проведение специальных колориметрических анализов для определения пентозных компонентов нуклеиновых кислот.
Более удобный способ определения количества ДНК и РНК основан на их способности поглощать УФ-свет при 260 нм, Другие методики, меньше отвечающие целям данного руководства, описаны в рекомендуемых изданиях 159, 631. Для количественного определения нуклеиновых кислот в культурах бактерий по описанным ниже методикам необходимо, чтобы клетки присутствовали в достаточном количестве в среде, не мешающей определению, или чтобы их можно было собрать из ростовой среды, отмыть от компонентов среды, мешающих определению, и ресуспенднровать в нужной концентрации в отсутствие лизиса бактерий или гидролиза нуклеиновых кислот нуклеазами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
