Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 62
Текст из файла (страница 62)
После пропускания растворителя хроматограмму высушивают в течение ночи в вытяжном шкафу и режут на полоски. Одну из полосок, содержащую глицерофосфат, опрыскивают реактивом Драгепдорфа, другую опрыскивают нингидрином, а третью— реактивом Форбека и Маринетти, состоящим из смеси салицилсульфоновая кислота — трихлорид железа [33) (см.
ниже). Фосфатидилэтаноламин (71~=0,66) и фосфатидилсерин (Я~=0,28) после опрыскивания нингидрнном и выдерживання в течение нескольких часов при комнатной температуре дают розовато-лиловые пятна. Фосфатидилхолин (Рт=0,86) и фосфатидилэтаноламин (1сг=0,80) после обработки реактивом Драгендорфа проявляются в виде оранжевых и бледно-оранжевых пятен соответственно и не дают никакой окраски с нин- 320 1т. химический сОстАВ гидрином. Все реакции с реактивом салицилсульфоновая кислота — трихлорид железа описаны ниже.
Определение глицерофосфагов на хроматограммах при помощи реактива салицилсульфоновая кислота— трихлорид железа 1191. Растворяют 1,5 г РеС!з бНаО в 30 мл 0,3 н. НС1 и разбавляют 90 мл ацетона. Погружают в этот реактив полоски бумаги, вырезанные из хроматограмм, сушат в вытяжном шкафу и затем вновь погружают в раствор, приготовленный растворением 1,5 г салицилсульфоновой кислоты в 100 мл ацетона.
Глицерофосфаты проявляются в виде белых пятен на розовато-лиловом фоне. 17.3.7. Жирные кислоты Одним из наиболее широко распространенных методов определения жирных кислот в бактериальных клетках является газожидкостная хроматография их метиловых эфиров, полученных из фосфолипидов, суммарных липидов и других липидных фракций.
Метанолиз липидов происходит при нагревании нх в смеси серной кислоты и метанола. Метиловые эфиры экстрагируют гексаном, после чего каждую из жирных кислот количествешю измеряют с помощью газохроматографического прибора, снабженного подходящей колонкой 1разд.
16.3.4). Для получения метиловых эфиров жирных кислот используют несколько методик. Одна из них, отличающаяся простотой и удобством, описана ниже. В ссылках на литературу можно найти и другие методики, известные к настоящему времени 125, 321. Реактивы и материалы Газовый хроматограф, снабженный пламенно-ионизанионным детектором и соответствующей электронной системой для регистрапии.
Существует несколько вариантов выбора хроматографических колонок и программ температурных режимов. При выборе газохроматографической методики, пригодной для данного прибора и анализируемого материала, исследователь может воспользоваться рекомендапиями, содержащимися в работах 120, 26, 29, 30, 321. н-Гексан, спектрально чистый 1Мегй апб Со., 1пс., йантчау, 1Ч. Л.). 321 ЧАСтЫтг. МЕТАБОЛНЗМ безг-ный раствор серной кислоты в метаноле: добавляют б мл (ж д. ан геакеп! кгабе) серной кислоты к эб мл безводного метанола.
Перед использованием каждый раз готовят свежий раствор. (Лредостереженпе1 См. равд 17хь1 н 17.3.1.) Стандарты, Метиловые эфиры, в состав которых входяг жирные кислоты Сы — Сз, с прямыми и разветвленными цепями ((.агобап Е!р!бз, Ма!гпо, Зттебеп, или Арркеб Бс!енсе Еаьога!ог!ез, 8!а!е Со!!ене, Ра.). Г1ирексовые пробирки на 1б мл со стеклянными пробками. Методика Вносят от 0,5 до 1 мг очищенных суммарных липидов (разд. 17.4.2) в пробирку со стеклянной пробкой и упаривают растворитель в токе азота при 30 — 37'С. К высушенным липидам добавляют 4 мл бого-ного (вес!' /объем) раствора серной кислоты в метаноле и нагревают 2 ч при 70'С. После охлаждения добавляют 4 мл н-гексана и встряхивают пробирку 10 мин.
Отделяют гексановый слой. Повторно экстрагируют метанольный слой 4 мл гексана. Для газохроматографического анализа используют объединенные гексановые экстракты (разд. 16.3.4). Метиловые эфиры жирных кислот идентифицируют, сравнивая их времена удерживания с временами удерживания известных жирных кислот. Количественное определение проводят путем сравнения площадей пиков с площадью пика внутреннего стандарта, внесенного в каждую пробу (26).
17.3.8. Поли-р-гидроксибутират 127! Поли р-гидроксибутират хотя и является липидом, однако не экстрагируется из бактериальных клеток растворителями, обычно используемыми для экстракции липидов, По методике, описанной Лоу и Слепеки [27], поли-р-гидроксибутират экстрагируется горячим хлороформом из клеток, предварительно обработанных гнпохлоритом для удаления мешающих веществ. В результате гидролиза образуется (з-гидроксимасляная кислота, которая в концентрированной серной кислоте дегидратируется и превращается в кротоновую кислоту. Кротоновая кислота поглощает УФ-свет с максимумом оптической плотности при 235 нм, обнсловленном двойной связью. 1т. химическии состАВ Реактивьг и риатериалы Раствор гипохлорита натрия: имеющийся в продаже раствор хлорной извести, например клорокс, или другая хлорная известь.
Кюветы: 1-см кюветы, изготовленные из кварца или другого ма. териала, пропускающего Уф-свет. Спектрофотометр для измерения поглощения в ультрафиолете. Полипропилеиовые или стеклянные центрифужные пробирки размером 12Х 100 мм аа 30 мл. Пластмассовые центрифужные пробирки нужно мыть горячим хлороформом и этанолом лля удаления властификаторов. (Предостережение! См. раза. 17.3.1.) Пентрифуга с охлаждением (скорость ло 10 000 З). Пирексовые термостойкие пробирки.
Мерная колба иа 10 мл. Баня с кипящей водой. Серная кислота (ч. Л. аи геакеп1 Кгабе). Качество серной кислоты имеет большое значение. Низкие сорта содержат вещества, поглощаюьцие ультрафиолет, из-за чего контрольные (слепые) пробы имеют высокую оптическую плоткость. (Предостережениет См. рази. 17.2.2.) Стандарт: 3-гилроксимасляную кислоту (0,5 мг/мл) растворяют в этаноле (1: 10) для получения раствора с концентрацией 50 мкг/мл. Методика Центрифугируют в течение 15 мин при 10000 д (4'С) такой объем культуры, в котором содержится 1Π— 20 мг (сухого веса) бактериальных клеток. Сухой вес определяют, взвешивая высушенные клетки из равного объема культуры (равд. 25.2.2). Добавляют гипохлорит натрия в количестве, равном первоначальному объему культуры, переносят суспепзию в центрифужную пробирку, инкубируют в течение 1 ч при 37'С и затем центрифугируют 15 мин при 10000 д для осаждения гранул липидов. Температура, при которой проводится центрнфугированне, не имеет значения.
Осадок суспендируют в воде и центрнфугнруют при 10000 д в течение 15 мнн. Надосадочную фракцию отбрасывают, а гранулы липидов, прилипшие к стенкам центрифужной пробирки, промывают сначала 5 мл ацетона, а потом 5 мл этанола. Это делают с целью удаления воды. В завершение липидпые гранулы суспеидируют в 5 мл ацетона г помощью встряхнватсля Уог(ех и центрифугируют 15 мин при 10000 К. Осадок суспендпруют в 5 мл этаиола, используя встряхнватель зттог(ех, и вновь центрифугируют 15 мин при 10000 д. ЗЯЗ ЧАСТЬ !Н.
МЕТАБОЛИЗМ Промытые гранулы растворяют в 3 мл кипящего хлороформа и инкубируют в кипящей бане в течение 2 мин. Раствор охлаждают и центрифугируют 15 мнн при 10 000 д прн комнатной температуре. Надосадочную фракцию переливают в 1О-мл мерную колбу, а осадок дважды экстрагируют 3 мл хлороформа в течение 2 мнн при 100'С. Если раствор непрозрачный, его фильтруют горячим через фильтровальную бумагу %)та1шап № 1 (предварительно промытую горячим хлороформом).
Хлороформные экстракты объединяют и доводят хлороформом до 10 мл. Все операции с хлороформом выполняют в вытяжном шкафу. 1)7 редостережение! См. разд. 17.3.1.) Пробы хлороформного экстракта, содержащие от 5 до 50 мкг полимера и 5 — 1О стандартных растворов, в состав которых входит от 5 до 50 мкг 0-гидроксимасляной кислоты в этаноле, вносят в стеклянные термостойкне пробирки. Пробирки погружают в кипящую водяную баню до выпаривания растворителей. Добавляют по 10 мл серной кислоты, закрывают пробирки стеклянными шариками и нагревают в кипящей водяной бане 1О мин.
Растворы охлаждают я тщательно перемешивают. Измеряют оптическую плотность растворов при 235 нм, используя в качестве контроля серную кислоту !разд. 16.1.1). Количество р-гндрокснбутнрата определяют по калибровочной кривой, Количество поли-5-гидроксибутнрата на 1 г сухого веса биомассы бактерий рассчитывают исходя из сухого веса клеток в культуре.
Применение методики Описанная выше методика подходит для определения количества полн-5-гидроксибутирата в лиофялизованных клетках илн в биомассе, полученной при центрнфугировании. Определению мешают другие р-гидроксикислоты и некоторыесахара, так как они превращаются в вещества, поглошающие УФ-свет при 235 нм. Сахара удаляют обработкой гнпохлоритом с последующей экстракцней поли-3-гндроксибутирата хлороформом. Другие клеточные вещества также иногда образуют продукты, поглощающие УФ-свет. Рекомендуется сравнивать спектр поглощения вещества, образуемого бактериальны- 324 гх хнмнческин состав ми клетками, со спектром поглощения стандарта для того, чтобы убедиться, что поглощение обусловлено кротоновой кислотой (разд.
16.1.1). 17.4. ПОЛИМЕРЫ КЛЕТОЧНОР1 СТЕНКИ Химические и структурные различия клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий весьма значительны. У грамположительных бактерий пептидогликаны могут составлять 40 — 90'/а веса выделенных клеточных стенок (15 — 20% веса сухих клеток), у грамотрицательных — менее 107~о, а у некоторых псевдомоиад — всего 1,2'7а 135 †, 44, 45, 58), Этот полимер контролирует форму прокариот, за исключением мико- плазм, галобактсрий, метанобразующих бактерий и других видов, относящихся к архебактериям [49].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
