Методы общей бактериологии (том 2) (947293), страница 57
Текст из файла (страница 57)
Затем добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты, так же быстро перемешивают и оставляют на 10 мни. (Осторожно! Прн добавлении серной кислоты происходит нагревание, а иногда и разбрызгивание сме- 295 ЧАСТЬ З'т'. МЕТАБОЛИЗМ си, что может вызвать тяжелые ожоги при попадании на кожу или в глаза. Необходимо пользоваться защитными очками и перчатками. Нельзя насасывать раствор в пипетку ртом.
Необходимо знать меры по оказанию первой помощи при попадании кислот на кожу и в глаза.) Пробирки помещают на 15 мин в водяную баню с температурой 25'С и затем снимают показания оптической плотности в каждой пробе при 488 нм против контрольного образца, приготовленного без глюкозы (разд. 16.1.1). Концентрацию глюкозы в пробах определяют по стандартной калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью стандартных растворов и концентрацией глюкозы. 17.2.3. Р-Глюкоза В результате гидролиза простых и сложных полисахаридов в бактериальных клетках образуется большое число моносахаридов. Поскольку полимеры состоят из различных мономеров, за исключением гомополимеров, таких, как гликоген, количественное определение отдельных сахаров представляет собой сложную аналитическую проблему, которую порой можно решить лишь с помощью газожидкостной хроматографии 1161.
Однако некоторые сахара н производные сахаров определяют с помощью специфических колориметрических реакций или ферментативных методов 141. Ниже приведем определения содержания двух наиболее широко распространенных сахаров Фермент глюкозооксидаза катализирует следующую реакцию: ~34ЬГлюкоза + Оа — а Глюкововая кислота + НаОа Перекись водорода в присутствии пероксидазы н восстановленного хромофора приводит к образованию окисленного хромофора, окрашенного в коричневый или синий цвет, количество которого можно измерить спектрофотометрически. В качестве хромофоров используются различные вещества. Смесь ферментов, необходимых для анализа, можно приобрести в комплекте у различных фирм. !г химиг!есхии сОстАВ Глюкозооксидазный тест специфичен, чувствителен и прост в осуществлении.
Окрашенные вещества в этой реакции появляются только за счет глюкозы и 2-дезоксиглюкозы. Реактивы Основной раствор глюкозы: 300 мг )з-глюкозы растворяют в 100 мл 0,157р-ной (вес/объем) бензойной кислоты. Хранят в холодильнике. Перед применением разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1: 10 и доводят рН до 7,0. Коммерческий препарат глюкозооксндазы — пероксидазы. Готовят смесь ферментов, как указано в инструкции к препарату. Хромофор.
Входит в комплект имеющихся в цродаже реактивов. Готовят согласно инструкции. Методика Пробы разбавляют дистиллированной водой так, чтобы они содержали 0,05 — 0,3 мг глюкозы в 1 мл. Устанавливают рН от 6,8 до 7,2 добавлением 0,1 н. КОН или 0,1 н. НС1. Для определения рН можно пользоваться индикаторной бумагой. Готовят контрольную пробу и серию стандартов, содержащих 0,05 — 0,3 мг глюкозы в 1 мл, путем разбавления дистиллированной водой.
Добавляют фермент и хромофор и инкубируют смесь согласно инструкции фирмы-изготовителя. Добавляют пастеровской пипеткой 1 каплю 4 н. НС1 и определяют оптическую плотность в стеклянной кювете при 400 нм (равд. 16.1.1). Определяют концентрацию глюкозы в пробах по стандартной калибровочной кривой, отражающей зависимость между оптической плотностью стандартных растворов н концентрацией глюкозы. 17.2.4.
Галактоза Комплект реактивов для определения галактозы с помощью галактозооксидазы также можно приобрести у различных фирм. В комплект входят галактозооксидаза, хромофор и стандарты. Поскольку галактозооксидаза окисляет Се-гидроксиметильную группу галактозы с, образованием галактуроновой кислоты, она может окислить и некоторые галактозиды. ЧАСТЫУ.
МЕТАБОЛИЗМ Призгенение оксидазного теста на глюкозу и галактозу Оксидазный тест на глюкозу и галактозу позволяет определять содержание этих веществ в ростовых средах, в нейтрализованных гидролизатах полнсахаридов и в ферментных реакционных смесях, например содержание глюкозы при ферментативном гидролизе целлюлозы, ит.п. Глюкозооксидаза окисляет только р-ь)-глюкозу, но в присутствии мутаротазы (входящей в некоторые имеющиеся в продаже препараты) она позволяет определять и а-1)-глюкозу.
Для проверки возможного влияния солей и других ингибиторов в каждый неизвестный раствор целесообразно добавлять стандарт без углеводов. 17.2.5. Глнкоген Оценить содержание у бактерий любого простого полисахарида, кроме гликогена, с помощью несложных методик довольно трудно. Здесь мы опишем способ выделения гликогена, так как этот полимер служит резервным материалом у многих бактерий и может составлять значительную часть их биомассы. Способы выделении других широко распространенных сложных полисахаридов (липополисахаридов и пептидогликанов) приведены в других разделах. Гликоген, как и другие полисахариды, устойчив к гидролизу щелочами, ои хорошо растворим в воде и нерастворим в этаноле.
Выделение полимера основано на использовании именно этих свойств. Содержание глюкозы в выделенном гликогене можно определить в кислотных гидролизатах с помощью реакций сантроном или фенолом или с помощью глюкозооксидазного теста после 6-часового гидролиза полисахарнда в 4 н. НС1 при 100'С в запаянной ампуле. Реактивьг и оборудование Абсолютный зтанол. Гпдрокснд калия: 30%-ный (вес/объем) раствор в дистиллированной воде. (Осторожно: пгелоаь! Нельзя насасывать раствор в пипетку ртом.
Следует избегать попадания реактива иа кожу и в гла ва.) 298 гг. химичвскии сОстАВ Центрифуга с охлаждением, работающая со скоростями до 10000 К. 30-мл стеклянные нентрнфужные пробирки. Методика Клетки собирают центрифугированием при 5000— 10000 д в течение 15 мин, ресуспендируют в равном объеме физиологического раствора и снова центрифугируют. Еще раз промывают клетки, центрифугируют и лиофилизуют их (равд. 12.2.1). 100 мг сухих клеток помещают в пирексовую илн кимаксовую пробирку, имеющую завинчивающуюся крышку с тефлоновой прокладкой, вносят в нее 1 мл 30%-ного КОН и инкубируют в паровой илн кипящей бане в течение 3 ч при 1ОО'С.
Если лиофнлизация нецелесообразна, суспендируют 500 мг сырых клеток в 0,6 мл 50%-ного (вес/объем) КОН и нагревают при 100'С для солюбилизации гликогена. Охлаждают пробирку, не открывая ее. После охлаждения добавляют 3 мл дистиллированной воды и 8 мл этанола для осаждения гликогена. Центрифугируют при 10000 д в течение 15 мин и осадок промывают 8 мл 60%-ного охлажденного этанола путем центрифугирования.
Высушивают осадок в вакуумном эксикаторе. В промытом осадке можно определить глюкозу антроповым нли фенольным методом (равд. 17.2.1 н 17.2.2). Можно также провести гидролнз для получения глюкозы н дальнейшего ее определения по глюкозооксидазной методике (равд. 17.2.3). Для полной экстракции глнкогена из грамположительных клеток иногда требуется их механическое разрушение 191. 17.2.6. Определение гексозаминов в очищенных пептидогликанах 15, 8 — 12) Гексозамины присутствуют в липополисахаридах, пептидогликанах и тейхоевых кислотах бактерий. Наиболее распространенные гексозамины — это глюкозамнн, галактозамин н мурамовая кислота.
Все Н-ацетилированные гексозамины реагируют с и-диметиламинобензальдегидом, вызывая образование продукта, окрашен- ЧАСТЬ 1Ч. МЕТАБОЛИЗМ ного в красный цвет. Этот тест очень чувствителен и специфичен для гексозаминов, однако ои пе позволяет дифференцировать глюкозамии, мурамовую кислоту и галактозамин. Мурамовую кислоту можно определять отдельно с помощью других методик (разд. 17.2.8).
Модифицированная методика Гуйзеиа и др. !111 более точна и удобна, чем описанная ниже методика Моргана — Элсоиа. Оиа позволяет определять суммарные гексозамипы в очищенных пептидогликанах. Однако для определения гексозаминов в сложных полимерах или бактериальиых клетках требуется отделить их от нейтральных сахаров методом иоиообмеииой хроматографии„ как это описано в следующей методике. Реактивы и оборудование Реактив Моргана — Элсоиа 16 г и-димстнламниобсизальдсп1дп растворяют в достаточном количестве уксусной кислоты для получения конечного объема 95 мл. )(сбавляют 5 мл концентрированной НС1. Разбавляют уксусной кислотой в соотношении 1: 5 для получения окрашивающего реактива.
(Предостережение! Необходимо работать в вытяжном шкафу во избежание вдыхания паров соляной н уксусной кислот. Во время приготовления и применения реактива следует надевать защитные перчатки, одежду и очки ) 3 н. НС1. 3 и. )ЧаОН. Насыщенный раствор бикарбоната натрия К 100 мл дистиллированной воды добавляют -!5 г )ЧаНСОз и перемешивают в течение 15 мии при комнатной температуре. 5 "тз-ный (объем/объем) уксусный ангидрид в дистиллированной воде готовят непосредственно перед применением и держат во льду. (Предостереясенае! Во избежание попадания жидкости или паров ма кожу и в глаза необходимо работать в вытяжном шкафу. Нельзя иасасывать раствор в пипетку ртом.) бзй-иый раствор КзВзО, в дистиллированной воде.
Стандартный раствор глюкозамина1 17,92 мг глюкозамииа растворяют в 10 мл 3 и НС!. Основной раствор хранят в холодильнике. Еженедельно готовят свежий раствор. Стандартный основной раствор содержит 0,2 мкмоля глюкозамина в 20 мкл. Раствор разбавляют 3 н. НС! для получения стандартных растворов, содержащих от 0,0! до 0,2 мкмоля глюкозамнна в 20 мкл. Ампулы: 1-мл ампулы для лнофилизации или 1-мл пробирки имеющие завничивающиеся крышки с тефлоиовыми прокладками.
Нирепсовые пробирки иа 3 мл. Спектрофотометр или колориметр. Стеклянные кюветы иа 1 мл. 300 17. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ Методика Лиофилизуют одну или несколько проб, содержащих от 0,01 до 0,1 мкмоля гексозамина. В каждую пробу добавляют по 20 мкл 3 н. НС1. Готовят стандартные растворы глюкозамина (0,01 — 0,2 мкмоля на 20 мкл 3 н. НС1). Пробы и стандартные растворы нагревают при 95'С в течение 4 ч. в запаянных ампулах или пробирках. Гидролизаты охлаждают и нейтрализуют добавлением 20 мкл 3 и. 5)аОН. В 3-мл пробирки переносят пв 30 мкл каждого гидролизата. Добавляют по 10 мкл насыщенного раствора 14аНСОз и по 10 мкл свежеприготовленного 5%-ного уксусного ангидрида.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
